专利名称：短棒状杆菌在制备治疗新型甲型h1n1流感病毒感染药剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)在制药领 域中的应用，尤其涉及在制备治疗新型甲型Hmi流感病毒药剂中的应用，属于药物领域。
背景技术：
流感是一种由流感病毒引起的、通过呼吸道传播的传染性疾病。历史上流感的大 流行曾经给人类造成过很严重的后果，例如1918年暴发的由Hmi亚型流感病毒引起的“西 班牙流感”，就是20世纪最具灾难性的流感，在不到一年时间里感染了全世界一半的人口， 导致数千万人死亡。流感大流行通常是由一种新出现的或者以前人未曾感染过的病毒引起 的，人体对这种新病毒没有免疫力，再加上其传播范围广、速度快，而疫苗的研制和生产又 很难立即跟上，所以容易造成许多人感染甚至死亡。近年来，随着全球经济发展的一体化程 度的不断加深，世界各国之间的人员往来和流动日益频繁和密切，从而使流感病毒在全球 的播散和蔓延的速率进一步加快，一旦某个国家或地区发生流感爆发，疫情将会在短时间 内迅速播散至世界各地。2009年发生的甲型Hmi型流感疫情正是如此。2009年4月，墨西哥确诊了首例甲型Hmi型流感病例。在随后的4月至5月期 间，甲型Hmi型流感疫情在世界范围内迅速蔓延，仅仅一个多月的时间内，全球多个国家 和地区均发生了甲型Hmi型流感疫情。以疫情最为严重的墨西哥和美国为例，截至2009 年5月14日，墨西哥全国确诊甲型Hmi流感病例上升至2720例，其中死亡人数上升至64 人；而在美国五十个州中，已有四十七个州宣布发现甲型Hmi流感病例，患者总数也上升 至4298人，比前一天增加946人。我国内地也于5月11日确诊了首例甲型Hmi流感病例， 截至2009年5月19日，共出现4例甲型Hmi流感病例，均为输入性流感病例。世界卫生 组织已于2009年4月29日宣布全球流感大流行警告级别为5级，并且随着甲型Hmi流感 疫情在世界范围内的不断蔓延，暴发全球流感大流行的风险日益提升，世界卫生组织已于5 月初明确表示不排除把警告级别升至6级，即宣布流感大流行到来的可能性。此次甲型Hmi型流感疫情发生后，世界各国的科学家们立即展开了相关的科学 研究工作。最新的调查和研究结果显示，每个感染新型甲型Hmi流感的墨西哥患者都会导 致增加1. 2至1. 6个新病例，证明流感病毒的人际传播在不断发生。这一流感病毒的传染 率，到目前为止是1/3，全球范围内可能会有20亿人受到这种流感病毒的感染，一场全球性 大流感现在已经初见端倪。但是由于目前尚不能确定新型甲型Hmi流感病毒的毒性、可传 播性和病毒的起源，并且该病毒的潜伏期和传染期也不是很明确，因此科学家们还无法判 断其在世界范围内扩散的程度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂 (NCP)在制药中的新应用，即在制备治疗新型甲型Hmi流感病毒感染中的应用，所述短棒状杆菌制剂是由短棒状杆菌(CP)经甲醛灭活后制成的制剂，所述NCP为纳米级、颗粒大小 均一、吸收度及扩散度提高，低热原、无甲醛残留，与全菌体制剂具有相同的脾激活及抑瘤 等生物学活性，可减少CPP的发烧、胸痛，注射局部红肿、硬结，肝肾毒性等副作用；短棒状 杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)作为一种非特异性免疫调节剂，均具有明 显的抗病毒的作用，可用于新型甲型Hmi流感病毒感染的治疗或辅助治疗。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种短棒状杆菌制剂在制备治疗 新型甲型Hmi流感病毒药剂中的应用。一种无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗新型甲型Hmi流感病毒药剂中的应用。本发明所述的短棒状杆菌制剂(CPP，2000版《中国生物制品规程》)是一种非特 异性免疫调节剂。它是由短棒状杆菌(CP)经甲醛灭活后制成的死菌苗，其制备过程公开在 1995版及2000版《中国生物制品规程》。目前应用的CPP制剂还有法国Merleux研究所生 产的灭活菌苗；英国Wellcome药厂生产的灭活菌苗等。CPP具有激活单核吞噬细胞系统的能力。CPP对免疫系统的作用主要表现在激活 单核巨噬细胞、使NK细胞活性增强、促进机体对多种抗原产生IgG和IgM、诱尘干扰素、白细 胞介素-2等，因此具有抗肿瘤和抗感染作用。CPP的抗肿瘤作用已为许多实验和临床研究所证实。对实验动物接种肿瘤前后应 用CPP，能显著抑制某些实体瘤(如乳腺癌、黑色素瘤等)、腹水型肿瘤及白血病的生长。肿 瘤消退的动物对于再次攻击的肿瘤细胞有特异性的抵抗力。CPP对肿瘤转移亦有抑制作用。CPP抗肿瘤及抗感染的核心是通过激活巨噬细胞，使其数量和质量大大提高，激活 的巨噬细胞可将肿瘤细胞及感染的微生物杀死。CPP作为免疫调节剂用于肿瘤及其它疾病的治疗已有数十年的历史，其通过激活 单核巨噬细胞系统抗肿瘤、抗感染的效果已被公认。02123571. 6,02123570. 8和02123572. 4已经申请了一种无细胞短棒状杆菌制剂、
其制备方法和在制备治疗结核病药物上的用途。本发明所述无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)为由短棒状杆菌(CP)经破碎制备的无 细胞制剂，粒度小于lOOnm。其中所述的CP，学名为粉刺丙酸杆菌(propionibacterium acnes)菌号为 65101 (76-27 或 7627),65102(H-84)或 65103 (77-1 或 771)。所述的NCP的热原小于160EU/ml，蛋白质含量10 40% (g/g)，核酸含量3 25% (g/g)，其余为多糖。优选本发明NCP的热原小于60EU/ml，蛋白质含量20 30% (g/g)，核酸含量3 10% (g/g)，其余为多糖。本发明NCP的粒度优选为50 80nm。本发明所述的NCP是通过下述步骤制备的1)CP工作种子批菌种连续2 4次传代后接种于大瓶或营养罐，在培养基中培养 5 7天2)收集无杂菌污染的菌体，加热煮沸15 60分钟得到菌液3)无菌试验合格的菌液经洗涤后，用破碎装置破碎菌体；4)菌体破碎后的悬液经离心后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液
5)将悬液分装后加热灭菌，得到无细胞短棒状杆菌制剂。其中步骤1)中所述的CP学名为粉刺丙酸杆菌，菌号为65101 (76-27或7627)、 65102(H-84)或 65103 (77-1 或 771)。培养基为选自硫乙醇酸盐、蛋白胨、肝或酵母透析液培养基中的一种，且为低热原
培养基。步骤1)中培养条件为36 37°C培养。优选所述培养基为不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。其中步骤3)中所述的菌体是灭活菌，菌体浓度为50 500亿/ml。所述破碎装置是将菌体破碎到小于lOOnm，优选粒度为50 SOnm的超高压射流对 撞机。其中所述菌体破碎是在无菌条件下进行。其中步骤3)中所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤至少2次步骤 4)中所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤O 5次。步骤4)菌体破碎后悬液的离心条件是在4°C 室温、6000 12000rpm离心30 150分钟。步骤5)中所述的加热为在60 65°C加热0. 5 2小时。本发明中所述培养基优选为经过0. 22 μ m或0. 45 μ m膜过滤的低热原培养基。本发明所述的制备方法中，还包括将步骤5)得到的NCP冷冻干燥，得到NCP的冻 干制剂。上述方法制备的NCP热原小于160EU/ml，蛋白质含量10 40% (g/g)，核酸含量 3 25% (g/g)，其余为多糖。优选上述方法制备的NCP热原小于60EU/ml，蛋白质含量20 30% (g/g)，核酸含 量3 10% (g/g)，其余为多糖。上述方法制备的NCP粒度小于lOOnm，优选粒度为10_50nm。本发明中所述的无菌检验合格是指按照《中国生物制品规程》规定的方法检验不 得有任何细菌生长。本发明中由于采用低热原培养基，特别是硫乙醇酸盐培养基，并结合严格的质控， 以及整个生产过程中无菌低热原操作，保证了最终产品低热原和无杂菌的污染。本发明通过超高压射流对撞机将CP破碎至纳米级，通过选择不同的离心力(转 速)，确定了离心提取条件，获得的沉淀部分为NCP，经多次动物试验证明，该制剂与全菌体 具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性，上清部分则无脾激活及抑瘤作用，表明本发明的 NCP具有良好的生物学活性。为了消除CPP中残留甲醛对机体的刺激性，尤其是对敏感胸膜的刺激性，本发明 中采用加热灭活替代了甲醛灭活。动物实验表明，加热灭活的NCP、CPP较甲醛灭活的CPP 具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性。超高压射流对撞机的工作原理是将混有被加工物的液体用高压泵(工作压力为 10-3000kgf/cm2)加压后分成两股，以高速射流进入两片直径为8mm人造金刚石晶片组成的 通道中，相向对撞后流出。由于液体的速度很高，流体相向对撞时产生很强的冲击波，使金 刚石晶片产生高频、高强超声波。大功率高频超声波使被加工物颗粒瞬间粉碎、超微化。
本发明的制备过程中，为更好地破碎菌体，采用超高压射流对撞机，在菌体浓度为 50 500亿/ml，工作压力为800 1500kgf/cm2的条件下破碎，破碎后的菌体悬液在4°C 室温下，6000 12000rpm离心30 150分钟，弃上清，沉淀用无菌生理盐水溶液洗涤0 5次后制成悬液，经配制、分装，在60 65°C加温0. 5 2小时，无菌试验合格后合并，得到 高质量、粒度和均一性良好的目的产品。本发明的NCP是将CP的细胞破碎至纳米级，经离心去除无效的上清部分，收集沉 淀部分制备的，产品具有低热原、无杂菌污染、无甲醛残留，颗粒具有纳米级，粒度均一，吸 收度和扩散度提高，有利于人体吸收并提高药效同时可减少发烧、胸痛，注射局部红肿、硬 结等副作用，是一种有前途的免疫制剂。根据需要，本发明的NCP可以制成无菌生理盐水 的悬浮制剂，固体含量为1. Omg/ml或2. Omg/ml，也可以制成冻干粉针或适合药用的其他剂 型本发明的CPP可为目前常用的剂型，如悬浮制剂、冻干粉针或适合药用的其他剂型。本发明所用的CPP、NCP均为非特异性免疫增强剂，NCP是由CP经破碎制备的无细 胞制剂，为纳米级、颗粒大小均一、吸收度及扩散度提高，低热原、无甲醛残留，与全菌体制 剂具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性，可减少CPP的发烧、胸痛，注射局部红肿、硬结， 肝肾毒性等副作用，因此NCP克服了 CPP的一些不足，可作为一种性能优异的非特异性免疫 增强剂应用于抗肿瘤和抗感染等疾病的治疗。本发明的CPP、NCP均为非特异性免疫增强剂，主要作用于巨噬细胞，对单核巨噬 细胞系统具有强大而持久的刺激，且可通过促进造血多能干细胞分化为单核巨噬细胞，调 动机体免疫系统蕴藏的潜力，发挥抗癌、杀微生物功能。CPP、NCP抗新型甲型Hmi流感病毒作用主要是通过对单核巨噬细胞系统强大而 持久的刺激，引起单核巨噬细胞增生、活化、吞噬功能增强及诱导分泌干扰素(IFN-Y)、白 细胞介素(IL-2)活性氧(Η202、Ν0)等杀伤因子及增强NK细胞杀伤活性，达到抑制和杀伤新 型甲型Hmi流感病毒的目的。随着对新型甲型Hmi流感病毒发病机理的深入认识和分子免疫学理论的发展， 非特异性免疫在抗新型甲型Hmi流感病毒中的作用，越来越被人们所重视。M吞噬细胞不 但在机体非特异性免疫中起重要作用，而且在特异性免疫中也起着非常重要的作用。单核 吞噬细胞系统除具有吞噬功能，还可发挥抗原呈递(antigenpresentation)作用，也属于 抗原呈递细胞(antigen-presentation cell，APC)，可辅助T淋巴细胞活化，并与淋巴细胞 相互刺激其功能，从而放大特异性免疫效应。然而只有活化的吞噬细胞才能发挥抗抗新型 甲型Hmi流感病毒效应，且活化的吞噬细胞抗新型甲型Hmi流感病毒不受新型甲型Hmi 流感病毒变异及对化学药物易产生耐药性的影响。故充分调动机体的免疫功能，在治疗新 型甲型Hmi流感病毒中有着重要的作用。本发明的一种短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂在用于制备治疗新型甲 型Hmi流感病毒药剂时，其用法为1-7次/周，每次0. 5 4mg，肌肉注射或其他适宜途径 给药，1 4周为一个疗程或遵医嘱。可间隔用或连续使用几个疗程。由于流感病毒的易变异性，很多流感病毒产生了对抗病毒药物的耐药性，限制了 化学预防和治疗药物的效力，使得很多抗流感病毒的化学药物疗效降低或失效。最新研究 发现新型甲型Hmi流感病毒对金刚烷胺和金刚乙胺耐药，对奥司他韦、扎那米韦和达菲敏 感，但疗效并不确定。本发明的短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂经动物实验证实对新型甲型Hmi流感病毒的感染具有很好的治疗作用。本发明所用的CPP、NCP为一种免疫调节剂，用于制备治疗新型甲型Hmi流感病毒 药剂，具有如下优点1.本发明提供了 CPP、NCP新的医药用途，对治疗新型甲型Hmi流感病毒提供了 新的途径。2.本发明的NCP制剂具有低热原、无杂菌污染、无甲醛残留，颗粒具有纳米级，粒 度均一，吸收度和扩散度提高，有利于人体吸收并提高药效；同时可减少发烧、胸痛，注射局 部红肿、硬结，肝肾毒性等副作用，是一种有前途的免疫制剂，可作为用于制备治疗新型甲 型Hmi流感病毒药剂。3.本发明的制备工艺简单，可制成口服液、注射液、片剂等剂型，使用方便。4.本发明的NCP制剂克服了化学药物治疗新型甲型Hmi流感病毒易产生耐药性 的缺点。本发明的制备方法、吸收性能及动物急性毒性实验的具体实施方式
同专利 ZL03157454. 8。
具体实施例方式以下具体实施方式
用于详细描述本发明，并不对本发明构成限制。实验例INCP对小鼠新型甲型Hmi流感病毒感染的保护作用1.材料和方法1. 1、供试品:NCP(2mg/ml)，4°C存放，使用时生理盐水配制。0. 25mg/只，0. 5mg/ 只，lmg/只1.2、病毒新型甲型Hmi流感病毒，来自WHO，在鸡胚尿囊腔中传代，实验病毒为 E22 23代，血凝滴度在1/180以上(鸡胚10 11天胚龄)。1. 3、小鼠昆明种小鼠，体重10 12克，1.4、小鼠流感病毒毒素保护试验小鼠肌肉注射NCP后不同时间静脉注射新型甲 型Hmi流感病毒，设病毒对照组，观察死亡，计算保护率。2.实验过程2. 1动物模型小鼠静脉注射新型甲型Hmi流感病毒1 X IO5病毒/0. 2ml/只2. 2剂量、分组和给药1)正常对照组20只，肌肉注射生理盐水0. 2ml/只2)病毒对照组20只 3)高剂量组lmg/0. 2ml/ 只，20 只4)中剂量组0. 5mg/0. 2ml/ 只，20 只5)低剂量组0. 25mg/0. 2ml/ 只，20 只NCP给药方法动物染毒后4小时肌肉注射给药2. 3观察测定观察一周小鼠死亡情况，计算保护率。表1 小鼠肌肉注射NCP 24小时后对感染新型甲型Hmi流感病毒的保护作用 *P < 0. 01从表1可见，NCP组对24小时后感染的新型甲型Hmi流感病毒有明显的保护作 用。中剂量组可保护100%，使小鼠免于死亡，P <0.01。结果表明，肌肉注射NCP可明显 保护小鼠对新型甲型Hmi流感病毒的感染。实施例21.材料和方法1. 1、供试品CPP，1.2、病毒新型甲型Hmi流感病毒，来自WHO，在鸡胚尿囊腔中传代，实验病毒为 E22 23代，血凝滴度在1/180以上(鸡胚10 11天胚龄)。1. 3、小鼠昆明种小鼠，体重10 12克，1. 4、小鼠流感病毒毒素保护试验小鼠肌肉注射CPP后不同时间静脉注射新型甲 型Hmi流感病毒，设病毒对照组，观察死亡，计算保护率。2.实验过程2. 1动物模型小鼠静脉注射新型甲型Hmi流感病毒1 X IO5病毒/0. 2ml/只2. 2剂量、分组和给药1)正常对照组20只，肌肉注射生理盐水0. 2ml/只2)病毒对照组20只3)高剂量组60亿个细胞/只，20只4)中剂量组30亿个细胞/只，20只5)低剂量组15亿个细胞/只，20只NCP给药方法动物染毒后4小时肌肉注射给药2. 3观察测定观察一周小鼠死亡情况，计算保护率。3.结果表2 小鼠肌肉注射CPP 24小时后对感染新型甲型Hmi流感病毒的保护作用 *P<0. 05从表2可见，CPP组对24小时后感染的新型甲型Hmi流感病毒有一定的保护作 用。中剂量组可保护60%，使小鼠免于死亡，P <0.05。结果表明，肌肉注射CPP可一定程 度的保护小鼠对新型甲型Hmi流感病毒的感染。
权利要求
一种短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗新型甲型H1N1流感病毒感染药剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗新型 甲型Hmi流感病毒感染药剂中的应用，其特征在于，其中所述短棒状杆菌制剂是由短棒状 杆菌经甲醛灭活后制成的制剂。
3.根据权利要求1所述的短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗新型 甲型Hmi流感病毒感染药剂中的应用，其特征在于，其中所述的无细胞短棒状杆菌制剂是 由短棒状杆菌经破碎制备的无细胞制剂，粒度小于lOOnm。
4.根据权利要求1或3所述的短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗新 型甲型Hmi流感病毒感染药剂中的应用，其特征在于，其中所述的无细胞短棒状杆菌制剂 热原小于160EU/ml，蛋白质含量10 40% (g/g)，核酸含量3 25% (g/g)，其余为多糖。
5.根据权利要求1或3所述的短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗新 型甲型Hmi流感病毒感染药剂中的应用，其特征在于，其中所述的无细胞短棒状杆菌制剂 的粒度为50 80nm。
6.根据权利要求3所述的无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗新型甲型Hmi流感病 毒感染药剂中的应用，其特征在于，其中所述的短棒状杆菌为粉刺丙酸杆菌，菌号为76-27、 H-84 或 77-1。
7.根据权利要求1或4所述的无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗新型甲型Hmi流 感病毒感染药剂中的应用，其特征在于，其中所述的无细胞短棒状杆菌制剂热原小于60EU/ ml。蛋白质含量20 30% (g/g)，核酸含量3 10% (g/g)，其余为多糖。
8.根据权利要求1所述的短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗新型 甲型Hmi流感病毒感染药剂中的应用，其特征在于，其中所述的无细胞短棒状杆菌制剂通 过下述方法制备的1)短棒状杆菌工作种子批菌种连续2 4次传代后接种于大瓶或营养罐养基中培养 5 7天2)收集无杂菌污染的菌体，加热煮沸15 60分钟得到菌液；3)无菌试验合格的菌液经洗涤后，用破碎装置破碎菌体4)菌体破碎后的悬液经离心后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液5)将悬液分装后加热灭菌，得到无细胞短棒状杆菌制剂。
9.根据权利要求8所述的短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗新型 甲型Hmi流感病毒感染药剂中的应用，其特征在于，其中所述的培养条件为36 37°C ；所 述培养基为不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基；所述的菌体是灭活菌，所述破碎装置是将菌体 破碎到小于lOOnm，优选粒度为50 SOnm的超高压射流对撞机，破碎在无菌条件下进行 步骤3)中所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤至少2次步骤4)中所述的洗 涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤0-5次菌体破碎后悬液的离心条件是在4°C 室 温下，6000 12000rpm离心30 150分钟；步骤5)中所述的加热为在60 65°C加热 0. 5 2小时。
10.根据权利要求8所述的短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗新型 甲型Hmi流感病毒感染药剂中的应用，其特征在于，将步骤5)得到的无细胞短棒状杆菌制剂冷冻干燥，得到无细胞短棒状杆菌的冻干制剂。
全文摘要
本发明涉及一种短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)在制药领域中的应用，尤其涉及在制备治疗新型甲型H1N1流感病毒药剂中的应用。所述短棒状杆菌制剂是由短棒状杆菌经甲醛灭活后制得的制剂，所述无细胞短棒状杆菌制剂为纳米级、颗粒大小均一、吸收度及扩散度提高，低热源、无甲醛残留；本发明的CPP具有一定的抗新型甲型H1N1流感病毒的作用，尤其以NCP的效果更为明显。
文档编号A61P31/16GK101919878SQ20091008659
公开日2010年12月22日 申请日期2009年6月12日 优先权日2009年6月12日
发明者高尚先 申请人:上海铭源数康生物芯片有限公司