>[0036] 术语"嵌合病毒"指代包含编码嵌合蛋白的嵌合基因的病毒。"嵌合基因和/或蛋 白"的意思是所述基因或蛋白质通过至少两种基因组分或两种蛋白质组分的组合获得，适 当的是，其来自至少两种不同的供体病毒。举例来说，在流感病毒A或B型的情况下，所述 嵌合基因和/或蛋白质可W是嵌合HA和/或嵌合NAvRNA或蛋白质。
[0037]术语"减毒病毒"指代在化许细胞中复制巧在动物或人中部分或其至令部丧失复 制能力的病毒。因此减毒病毒的毒力在人和动物中大大降低或甚至完全丧失。与减毒病毒 感染相关的临床症状在动物或人中是减少的或完全丧失。减毒病毒的实例为本领域熟知。 减毒病毒可W从，举例来说，野生型病毒通过系列传代（举例来说，在不同的培养基底上， 或在与其最佳复制温度相比较低的温度）、重组DNA技术、定点诱变、基因操作来制备。在本 发明中有用的减毒病毒可在大多数接种个体中不产生副作用或产生低强度副作用，同时保 持其在受试者中诱导保护性免疫应答的能力。
[003引术语"失活病毒"指代在允许细胞中不能复制至任何显著程度的病毒。病毒可通 过本领域的技术人员已知的多种方式失活。病毒失活方法的实例包括基因操作、化学或物 理处理或放射处理（包括甲醒、0 -丙内醋、洗漆剂、热或通常为X-射线或紫外福射形式的 电磁福射）。在本发明的框架中，有用的失活流感病毒是在受试者中保持诱导保护性免疫应 答的能力的那些。
[0039] 术语"反向遗传"指产生感染性、重配病毒，或来自其互补DNAs(cDNAs)的 减毒病毒的分子方法。该些方法通过在不同流感病毒中vRNAs的重配而对用于产生 重配流感病毒十分有利。所述反向遗传方法为本领域的技术人员熟知。所述反向 遗传方法可W是那些上文描述的方法，例如，使用描述于Neumanetal, 1999,Proc NatlAcadSciUSA, 96 (16): 9345-9350;Neumannetal, 2005,ProcNatlAcadSci USA，102(46):16825-16829;aiangetal，2009，JVirol，83(18):9296-9303;Massinet al, 2005,JVirol, 79 (21) : 13811-13816;Murakamietal, 2008, 82 (3) : 1605-1609 的质粒； 和 / 或描述于Neumanetal，1999，Proc化tlAcadSciUSA，96(16):9345-9350;Neumann etal,2005,ProcNatlAcadSciUSA,102(46):16825-16829；Zhangetal, 2009,J Virol, 83(18):9296-9303；Massinetal, 2005,JVirol, 79(21):13811-13816；Murakami etal, 2008, 82(3) :1605-1609；Koudstaaletal,2009,Vaccine,27 (19):2588-2593 ； ScMcklietal, 2001，PhiloslYansRSocLondBiolSci, 356 (1416): 1965-1973; Nicolsonetal, 2005,Vaccine, 23(22):2943-2952；Legasteloisetal, 2007,Influenza OtherRespiViruses, 1 (3):95-104;Whiteleyetal, 2007,InfluenzaOtherRespi Viruses, 1 (4) : 157-166 的细胞的方法。
[0040] 优选地，所述方法可W是：
[0041] (i) 16 质粒方法，如由Neumanetal, 1999,ProcNatlAcadSci USA, 96 (16) : 9345-9350 描述和在US2009/0246830 或US2011/0143424 中描述的方法，在 该方法中所述流感病毒通过使用多胺衍生物（TransIT-LTl)用如下质粒转染产生：各自 包含受到RNA聚合酶I启动子和RNA聚合酶I终止子控制的、与一种流感vRNA互补的cDNA 的8质粒，和各自包含受到RNA聚合酶II启动子控制的、与PA、PB1、PB2、NP、HA、NA、M和 NSmRNAs中的一种互补的cDNA的8质粒。具体地，所述细胞是人肾胚粘附细胞（293T细胞 系）；
[0042] (ii) 12 质粒方法，如由化doretal, 1999,JVirol，73(ll) : 9679-9682 描述和在 US2004/0142003、US2012/0058538中描述的方法，其中所述流感病毒通过用8质粒和4质 粒转染第一细胞类型，且进一步在第二细胞类型中扩增所述病毒生成，其中所述8质粒各 自包含与一种流感vRNA互补的、受RNA聚合酶I启动子和RNA聚合酶I终止子（了型肝炎 核酶）控制的cDNA，且所述4质粒各自包含与NP、PA、PB1和PB2mRNAs中的一种互补的，受 RNA聚合酶II启动子控制的cDNA。具体地，所述第一细胞类型是Vero细胞且所述第二细 胞类型是MD服；
[0043] (ii;L) 13 质粒方法，如由DeWitetal, 2007,JournalofGeneral Virology, 88:1281-1287描述的方法，其中所述流感病毒通过用8质粒、4质粒和一个质粒 转染细胞生成，其中所述8质粒各自包含与一种流感vRNA互补的、受T7RNA聚合酶启动子 和T7RNA聚合酶终止子控制的cDNA，所述4质粒各自包含与NP、PA、PB1和PB2mRNAs中的 一种互补的、受RNA聚合酶II控制的cDNA，且所述一个质粒包含受RNA聚合酶II控制的与 编码T7RNA聚合酶的mRNA互补的cDNA和核定位信号。具体地，转染的细胞是Vero、293T 或QT6(来自日本鹤譜的纤维肉瘤细胞系）细胞。
[0044] (iv) 8质粒方法，如由Hoffmannetal, 2000, PNAS, 97(11) : 6108-6113描述和在 W0 01/83794中描述的方法，其中每种质粒能够表达mRNA和vRNA(S)。因此每种质粒包含 与一种流感vRNA互补的cDNA和两种转录盒而不是如前面情况中的一种。与八种流感病毒 vRNAs中的每一种互补的cDNA被插入聚合酶I终止子和聚合酶I启动子之间。该聚合酶I 转录单位两侧具有聚合酶II启动子和多腺巧化信号。第一转录盒允许cDNA W vRNA的形 式转录。第二转录盒允许cDNA W mRNA的形式转录，随后使用细胞机器将其翻译成病毒蛋 白质。借助用于转录的该双盒系统，也称为化1 I-Pol II系统，相同质粒的cDNA W vRNA 和mRNA两种形式转录。该证实了其本身通过vRNA的表达使得一种或多种病毒蛋白处于转 染细胞的水平。具体地，在粘附MDCK细胞与293T细胞的共配养中，使用多胺衍生物（顺式 IT-LT1)作为转染剂。
[0045] (V)3 质粒方法，如由Neumannetal, 2005,PNAS, 102 (46) : 16825-16829 描述的方 法，其中流感病毒通过用包含与PB2、PBl、PA、HA、NP、NA、M和NSvRNAs互补的8种cDNA的 一个质粒（其中每种cDNA都受到RNA聚合酶I启动子和聚合酶I终止子的控制）和两种 质粒（第一种包含与PB2、PB1和PAmRNAs中的一种互补的3种cDNA且第二种包含与NP mRNA互补的cDNA，受RNA聚合酶II启动子的控制）转染细胞生成。具体地，转染的细胞是 293T或Vero。
[0046] (vi) 1 质粒方法，如由Slangetal,J.Virol. , 83 (18) : 9296-9303 描述的方法，其 中流感病毒通过用一个质粒转染细胞生成，所述质粒包含与PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和 NSvRNA互补的8种cDNA，其受鼠科动物聚合酶I终止子和鸡RNA聚合酶I启动子控制，并 且在？82、？81、?4和^〇0臟3之间具有聚合酶11启动子和多腺巧化信号。具体地，转染细 胞为祀F细胞。
[0047] (vii)描述于W0 2005/062820中使用两种不同细胞系统的方法；在第一步中，用8 种双向质粒与化Il-Polll系统（PoI/PoII)转染细胞且随后在第二步中，转染的细胞与来 自另一种对流感病毒允许度非常高的细胞系的细胞共同培养进而扩增所述流感病毒的生 产。具体地，所述的第一步中的转染细胞是Vero细胞，且所述第二步中的其他细胞系是CEK 或CEF细胞系，其是来自于鸡胚胎细胞的细胞系。
[0048]"流威病毒帝白"指A型流感的PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2/肥P蛋 白，B型流感的PBl、PB2、PA、HA、NP、NA、NB、Ml、BM2、NSl和NS2/肥P蛋白，或C型流感的PB1、PB2、PA、肥F、NP、M1、M1'、CM2、NS1和NS2/肥P。
[0049]"形成核糖核軍白复合体所需的流感病毒軍白"意为用于A、B或C型流感病毒的蛋 白PA、PB1、PB2 和NP。
[0化0] "vRNA"意为流感病毒的负父病毒RNA，其被封装入核糖核軍白复合体内。当流感 病毒是A或B型，所述vRNAs是PB2、PBl、PA、HA、NP、NA、M和NSvRNAs。当流感病毒是C 型，所述vRNAs是PB1、PB2、PA、肥F、NP、M和NSvRNAs。
[0化1] "cRNA"意为与vRNA互补的正义RNA中间体。一旦在细胞核中，进入的负义病毒RNA(vRNA)通过引物依赖机制被转录成为信使RNA(mRNA)。该些mRNA产物是vRNA模板的 不完整拷贝且被加帽和聚腺巧酸化，而非vRNA。复制经由两步过程发生。首先生成被称为 互补RNA(cRNA)的全长的vRNA正义拷贝，随后W其作为模板生成更多的vRNA。
[0化2] 重组盒、载体及其用途
[0化引本发明的目的之一是提供可用于将与负性单链RNA病毒的vRNAs互补的cDNAs克 隆入表达载体中的新型重组盒。因此所述重组盒对克隆与A型和B型流