细胞（Massinetal，2005,JVirol, 79 (21): 13811-13816; Murakamietal, 2008, 82 (3): 1605-1609)。另一方面，使得编码病毒蛋白质的mRNA得W 产生的质粒通常包含能在任何真核细胞中作用的巨细胞病毒（CMV)或0肌动蛋白P0LII 启动子（Neumanetal, 1999,Proc化1:1AcadSciUSA, 96(16) :9345-9350;Schickliet al,2001,PhilosTransRSocLondBiolSci,356 (1416):1965-1973)〇
[0014]多数情况下，在上述的反向遗传系统中，所述细胞通常在含有血清的培养基中进 行培养来确保转染前不同细胞类型的旺盛生长。此外，来自猪源的膜蛋白酶也被用于感染 培养基来支持感染后病毒的增殖。为获得足够病毒，在第一步的转染后在卵或细胞上的多 次扩增可能也是需要的。
[0015] 大流行的A/H1N1 (2009)病毒证明了流感A病毒能够在群体中传播的速度并表明 了通过反向遗传加速重配生产的需求。因此，主要的挑战是确保在最短时间内生产大量的 疫苗并在全世界配发，理想情况下快于病毒的蔓延。
[0016] 用于克隆的常规方法需要限制性内切酶。然而，限制性内切酶位点通常存在于与 vRNA互补的不同流感cDNA中，需要实施载体修饰或病毒基因组诱变。之前开发了简化的重 组方法用于克隆与vRNA互补的流感cDNA用于反向遗传目的（Stechetal, 2008,Nucleic AcidRes，36(21):el39;Wangetal, 2008,JVirolMethods, 151(1): 74-78)。同源重组 包括在两DM分子之间的相同DM序列区中的断裂和再结合过程来产生遗传材料的新组 合（Wattetal, 1985,Proc化tlAcadSci, 82:4768-4772)。该些之前描述的重组克隆系 统基于25核巧酸重组盒，其包括位于人POLI启动子和终止子之间的流感A片段的共有 5'扣nil3)和3'扣nil2)保守非编码末端。其使得任何流感A基因组的快速和直接克隆成 为可能。然而，由于流感B基因组的vRNA5'和3'非编码末端的核巧酸序列与流感A的不 同，流感B基因组不能基于该重组盒克隆。
[0017] 因此，对于尽快和尽可能有效地发展用于克隆RNA病毒基因组且特别是流感A、B 和C基因组的通用方式存在需求。
[0018] 本发明的目标是提供促进和/或加速流感疫苗在最理想的安全条件中生产的有 效工具和方法，特别是当新型循环流感病毒被鉴定且可能造成流行性或大流行流感时。
[0019] 为达到该种效果，本发明的主题设及用于生产传染性A型和B型病毒的大集合 (largepanel)的方法，其包括重配或嵌合的病毒，特别是通过反向遗传生成的病毒。该些 方法使得流感病毒在更安全的环境中生产更容易。另一方面，本发明提供了通用的重组载 体，其使任何类型的来自A或B型病毒的流感RNA片段得W克隆，其被证实是实施反向遗传 方法的有效工具。
[0020] 定义
[0021]"启动子"或"启动子序列"是能够与在细胞中存在的RNA聚合酶结合且起始下游 保方向）编码序列转录的DNA调节区。为了对本发明进行限定的目的，启动子序列在其 3'末端通过转录起始位点结合并向上游保方向）延伸来包括在背景W上的可检测水平 起始转录所需最小数目的碱基或元件。在启动子序列之内发现的是转录起始位点（举例来 说，通过与核酶S1绘图方便定义），W及引起RNA聚合酶结合的蛋白质结合域（共有序列）。 所述启动子可操作地与其他表达控制序列相关联，包括增强子和阻遏序列。举例来说人RNA 聚合酶I启动子（人RNAPOLI启动子）是与人RNA聚合酶I结合的一种启动子；鸟类RNA 聚合酶I启动子是与鸟类RNA聚合酶I结合的一种启动子，或T7聚合酶启动子是一种与瞻 菌体T7的RNA聚合酶结合的启动子。
[002引术语"裁体"、"克陈裁体"巧"表武裁体"意为媒介物，DNA(例如，外源DNA)通过它 可被引入宿主细胞中进而转化宿主并促进引进序列的表达（例如，转录和翻译）。载体包 括质粒、瞻菌体、重组病毒、瞻菌粒、转座子和人工染色体等；其在下文将进行更加详细的描 述。
[0023] 载体通常包含微生物的DNA，外源DNA插入其中。将一个DNA片段插入另一DNA片 段的通常方法包括称为限制性内切酶的酶的使用，其在称为限制性内切酶位点的特定的位 点（特定核巧酸组）裂解DNA。通常，外源DNA在载体DNA的一处或多处限制性内切酶位点插 入，且随后由载体携载与可传递的（transmiss油le)载体DNA共同进入宿主细胞。具有插入 的或添加的DNA的DNA片段或序列，如表达载体，也可被称为"DNA构建体"。载体的常用类型 是"质粒"，其通常是双链DNA的自足分子（self-containedmolecule),经常为细菌来源， 其可轻而易举接受额外的（外源的）DNA且可轻而易举被引入合适的宿主细胞。质粒载体经 常包含编码DNA和启动子DNA且具有一个或多个适于插入外源DNA的限制性内切酶位点并 经常包含终止序列。编码DNA是编码病毒的特定蛋白质或酶的特定氨基酸序列或vRNA片段 的DNA序列。启动子DNA是起始、调节或W其他方式介导或控制编码DNA表达的DNA序列。 启动子DNA和编码DNA可W来自相同基因或来自不同基因，且可W来自相同或不同生物体。 大量载体，包括质粒和真菌载体，已被描述用于在多种真核和原核宿主中复制和/或表达。 使用本文公开或引用的或W其他方式为相关领域技术人员已知的方法，非限制性的实例包 括地K质粒（Clontech)、pUC质粒、pET质粒（Novagen,Inc. ,Madison,WI)、pRSET或pREP 质粒(Invitrogen,SanDiego,CA)，或pMAL质粒(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)、 pVAXl质粒（Lifetechnology,Cergy化ntoise,FR)和许多合适的宿主细胞。重组克隆 载体经常包含一种或多种复制系统，在宿主中一种或多种用于选择的标记，例如，抗生素抗 性，W及一种或多种表达盒。重组克隆载体还可包含无抗生素选择系统，如描述于化ubez etal, 2010,MicrobialCellFactories, 9:65 的系统。
[0024] 本文所用术语"引物"指寡核巧酸的功能。引物是用于扩增祀序列的寡核巧酸，所 述扩增通常通过与祀序列杂交后所述寡核巧酸的延伸进行。
[002引 "RNA聚合酶II"意为在真核生物中催化DM转录成为mRNA或mRNA前体的酶。
[0026] "RNA聚合酶I"意为在直核牛物中催化DNA转录成为核糖体RNA(rRNA)或rRNA前 体的酶。
[0027] 术语"单向质粒"指仅包含一个转录盒的DNA质粒，如果所述转录盒包含与RNA聚 合酶I结合的聚合酶启动子，那么其使得所述DNA转录成为rRNA,或者如果所述转录盒包含 与RNA聚合酶II结合的聚合酶启动子，那么其使得所述DNA转录成为mRNA。举例来说，该 样的质粒包括由Neumanetal，1999，Proc化tlAcadSciUSA, 96(16) :9345-9350,和在 US2009/0246830 或US2011/014:3424 中描述的那些。
[002引术语"双向质粒"指包含两个转录盒的DNA质粒，由于第一转录盒包含与RNA聚 合酶I结合的聚合酶启动子且第二转录盒包含与RNA聚合酶II结合的聚合酶启动子， 其使得所述DNA转录成为rRNA和成为mRNA。举例来说，该种质粒包括由Hoffmanet al, 2000,PNAS, 97 (11) :6108-6113W及WO01/83794 描述的那些。
[0029] 术语"流感病毒"指正粘病毒(Orthomyxoviridae)科典型种（typespecies)。根 据本发明的流感病毒被描述于上文。
[0030] 根据本发明优选的流感病毒是流感A或B病毒。流感A或B病毒可W是病毒的任 何株。具体地，流感A病毒选自下组；H1N1、肥N2、册N1、册N2、册N8、册N1、H7N1、H7N7、H1N2、 H9N2、H7N2、H7N3 和H10N7 病毒。
[0031]"牵节忡或大流行忡病毒"意为从威染的宿丰，化人，中分离的流威病毒的临巧分 离株。
[0032]"传染忡流威病毒"意为能够在化许细胸(permissive)中复制的流感病毒。用于 确定病毒是否为传染性的方法为本领域的技术人员公知。举例来说，可使用TCIDg。测定法 来确定病毒是否为传染性的。TCIDg。是通过将增量稀释的样品引进允许细胞（如MDCK细 胞）并使用59631'111311-肪&61'统计学方法确定诱导50%允许细胞感染的稀释终点来评估样 品中（举例来说，感染的细胞培养上清，或感染的尿囊液）传染性病毒的量的方法。
[0033] 在一些实施方案中，所述传染性流感病毒可W是重配流感病毒、嵌合流感病毒、或 减毒流感病毒。优选地，所述传染性流感病毒是重配流感病毒，更优选的是，所述传染性流 感病毒是重配嵌合流感病毒。
[0034]"允许细胞"意为允许流感病毒穿透所述细胞且实现其完整复制循环直至生产新 的感染病毒的细胞。高度允许细胞是流感病毒在其中活跃复制且生成大量传染性病毒的细 胞。
[0035] 术语"重配適皇"指代包含至少两种供体病毒的遗传材料的组合产生的遗传材料 的病毒。当所述重配病毒被用于制备流感疫苗时，其遗传材料通常至少包含来自季节性和 大流行性病毒的HA和NA基因，而其他基因（骨架基因）来自一种或多种其他供体病毒，选 择该些供体病毒是由于它们在用于制造流感疫苗的生产基底上轻而易举生长的能力（如 鸡含胚卵的尿囊腔或允许细胞系）和/或对人而言是低病原体或不是病原体。作为骨架 基因"提供者"贡献的供体病毒的实施例包括A/化ertoRico/8/34OllNl) (A/PR/8/34)、B/ Lee/40 和 / 或B/Panama/45/90 病毒。