禽流感病毒及其H6亚型和N1亚型的GeXP快速检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中禽流感病毒及其H6亚型和N1亚型的GeXP快速检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus,AIV)根据表面糖蛋白（Hemagglutinin,HA) 和神经氨酸酶（Neuraminidase,NA)抗原性差异分为不同的亚型，目前已发现有16种HA亚 型（H1-H16)和9种NA亚型（N1-N9)，HA和NA的组合可产生至少135种亚型，其中，H5和 H7亚型中的部分组合（H5N1、H7N7和H7N9等）称为高致病性AIV，可感染人类并致死。低 致病性AIV感染虽然无任何症状或表现温和的、轻微的不典型症状，对畜禽和人类的健康 不具威胁性，但当不同亚型的低致病性AIV毒株混合感染畜禽时，可以在动物体内互相交 换基因，从而产生无法预测致病性和传染性的新变异株，这将对禽类和人类健康存在很大 的威胁。
[0003] H6亚型AIV属于低致病性AIV，但有报道表明1997年在香港爆发感染人的高致病 性H5N1病毒，除HA基因外，其余7个基因片段都与A/teal/HongKong/W312/97 (H6N1)病 毒高度相似，因此H6亚型AIV很可能成为高致病性H5亚型AIV的基因供体。2013年6月， 台湾发现了第一例人感染型H6N1亚型AIV，是一种低致病性禽流感病毒，其HA基因由台湾 H6亚型AIV支内进化而来。目前，H6亚型AIV受到广泛地关注，对养禽业和公共卫生有重 要的影响。
[0004] 鉴别诊断AIV的传统常规方法，主要包括病原分离鉴定和血清学试验等，但这些 方法常受临床病料新鲜度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁琐费时，对多重混合感染 的鉴别诊断就更为困难。近年来，随着分子生物学的发展，PCR技术已被广泛应用于这些呼 吸道病的检测。但基于常规PCR技术建立的多重PCR检测技术，需几对引物组合在一起同 时竞争地扩增，引物之间会产生相互干扰，多增加一对引物，敏感性就越低。PCR产物需要通 过琼脂糖电泳才可观察结果，该电泳难以区分50bp-100bp以内的条带，一般只可勉强做到 2-4重PCR，难以做到高通量检测。多重荧光PCR-般只检测到3重，由于探针要标记不同 发光波长的荧光基团，如标记太多的荧光基团，相互会产生干扰，导致检测结果不准确。并 且在多重PCR反应体系中同时存在几对引物，使得形成复杂引物二聚体的概率大大增加， 同时检测的目的基因数量有限，使得多重PCR还达不到高通量快速检测和分析的目标。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何鉴定禽流感病毒，并确定其HA亚型是否为H6 亚型及其NA亚型是否为N1亚型。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的成套引 物。
[0007] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的成套引物为成套引物1、成套引物 2、成套引物3或成套引物4;
[0008] 所述成套引物1包括名称为H6的PCR引物对、名称为N1的PCR引物对和名称为 M的PCR引物对；
[0009] 所述H6由H6-F和H6-R组成；所述H6-F为包含序列表中SEQIDNo. 1的第19-38 位核苷酸的单链DNA;所述H6-R为包含序列表中SEQIDNo. 2的第20-39位核苷酸的单链 DNA；
[0010] 所述N1由N1-F和N1-R组成；所述N1-F为包含序列表中SEQIDNo. 3的第19-38 位核苷酸的单链DNA;所述N1-R为包含序列表中SEQIDNo. 4的第20-38位核苷酸的单链 DNA；
[0011] 所述M由M-F和M-R组成；所述M-F为包含序列表中SEQIDNo.5的第19-38位核 苷酸的单链DNA;所述M-R为包含序列表中SEQIDNo. 6的第20-39位核苷酸的单链DNA;
[0012] 所述成套引物2包括所述H6和所述M;
[0013] 所述成套引物3包括所述N1和所述M;
[0014] 所述成套引物4包括所述H6和所述N1。
[0015] 上述成套引物中，所述H6可由序列表中SEQIDNo.1所示的单链DNA和SEQID No. 2所示的单链DNA组成；所述N1可由序列表中SEQIDNo. 3所示的单链DNA和SEQID No. 4所示的单链DNA组成；所述M可由序列表中SEQIDNo. 5所示的单链DNA和SEQID No. 6所示的单链DNA组成。
[0016] 上述成套引物中，所述成套引物1可由所述H6、所述N1、所述M和引物对G组成； 所述G由序列表中SEQIDNo. 1的第1-18位核苷酸所示的单链DNA和SEQIDNo. 2的第 1-19位核苷酸所示的单链DNA组成；
[0017] 所述成套引物2可由所述H6、所述M和所述G组成；
[0018] 所述成套引物3可由所述N1、所述M和所述G组成；
[0019] 所述成套引物4可由所述H6、所述N1和所述G组成。
[0020] 上述成套引物还可为成套引物5、成套引物6或成套引物7 ;
[0021] 所述成套引物5由所述M和所述G组成；
[0022] 所述成套引物6由所述H6和所述G组成；
[0023] 所述成套引物7由所述N1和所述G组成。
[0024] 上述成套引物中，所述G可用荧光染料标记，具体可为CY5。在本发明的一个实施 例中，所述G的一条单链DNA(SEQIDNo. 1的第1-18位核苷酸所示的单链DNA)为Y端被 CY5标记的单链DNA。
[0025] 为解决上述技术问题，本发明还提供了PCR引物对。
[0026] 本发明所提供的PCR引物对，为鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的PCR引物对M、鉴定 或辅助鉴定H6亚型禽流感病毒的引物对H6或鉴定或辅助鉴定N1亚型禽流感病毒的引物 对N1;
[0027] 所述H6由H6-F和H6-R组成；所述H6-F为包含序列表中SEQIDNo. 1的第19-38 位核苷酸的单链DNA;所述H6-R为包含序列表中SEQIDNo. 2的第20-39位核苷酸的单链 DNA；
[0028] 所述N1由N1-F和N1-R组成；所述N1-F为包含序列表中SEQIDNo. 3的第19-38 位核苷酸的单链DNA;所述N1-R为包含序列表中SEQIDNo. 4的第20-38位核苷酸的单链DNA；
[0029] 所述M由M-F和M-R组成；所述M-F为包含序列表中SEQIDNo.5的第19-38位核 苷酸的单链DNA;所述M-R为包含序列表中SEQIDNo. 6的第20-39位核苷酸的单链DNA。
[0030] 上述引物对中，所述H6可由序列表中SEQIDNo. 1所示的单链DNA和SEQIDNo. 2 所示的单链DNA组成；所述N1可由序列表中SEQIDNo. 3所示的单链DNA和SEQIDNo. 4 所示的单链DNA组成；所述M可由序列表中SEQIDNo. 5所示的单链DNA和SEQIDNo. 6 所示的单链DNA组成。
[0031] 为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的系统。
[0032] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的系统为下述H-Q中的任一种：
[0033] H、含有所述成套引物1的系统；
[0034]I、含有所述成套引物2的系统；
[0035]J、含有所述成套引物3的系统；
[0036] K、含有所述成套引物4的系统；
[0037]L、含有所述成套引物5的系统；
[0038] M、含有所述成套引物6的系统；
[0039] N、含有所述成套引物7的系统；
[0040] 0、含有所述M的系统；
[0041] P、含有所述H6的系统；
[0042] Q、含有所述N1的系统。
[0043] 上述鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的系统，还可包括通过GeXP遗传分析系统鉴定 或辅助鉴定禽流感病毒所需的试剂和仪器。具体来说，鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的系统 可包括所述成套引物1、所述成套引物2、所述成套引物3、所述成套引物4、所述成套引物5、 所述成套引物6、所述成套引物7、所述M、所述H6或所述N1以及GeXP遗传分析系统所需要 的其它试剂和仪器。
[0044] 上述鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的系统还可仅包括所述成套引物1、所述成套引 物2、所述成套引物3、所述成套引物4、所述成套引物5、所述成套引物6、所述成套引物7、 所述M、所述H6或所述N1。
[0045] 所述成套引物1、所述成套引物2、所述成套引物3、所述成套引物4、所述成套引物 5、所述成套引物6和所述成套引物7中的各引物对以及GeXP遗传分析系统所需要的其它 试剂均可独立包装。所述M、所述H6和所述N1以及GeXP遗传分析系统所需要的其它试剂 均可独立包装。
[0046] 上述鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的成套引物中，所述H6、所述N1、所述M和所述G 的每种引物对中的两条单链DNA均可独立包装。
[0047]GeXP遗传分析系统所需要的其它试剂可包括DNAPolymerase和/或MgCl# / 或lOXbuffer和 / 或dNTP和 / 或RandomPrimer(9mer)和 / 或dNTPMixture和 / 或RibonucleaseInhibitor和 / 或ReverseTranscriptaseXL(AMV)和 / 或DNAsize standardKit_400BasePairs和/或甲酰胺和/或分离缓冲液。
[0048] 上述系统中，所述H还包括记载有下述H1)和H2)的载体：
[0049] HI)在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的核酸（DNA或RNA或以RNA为模 板转录得到的cDNA)为模板，用所述成套引物1进行PCR扩增得到PCR产物；
[0050] H2)检测步骤H1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有194bp、249bp 和164bp的DNA片段，所述待测样品含有H6N1亚型的禽流感病毒或候选含有H6N1亚型的 禽流感病毒；如果所述PCR产物中含有194bp和164bp的DNA片段，所述待测样品含有H6 亚型的禽流感病毒或候选含有H6亚型的禽流感病毒；如果所述PCR产物中不含有194bp的 DNA片段，所述待测样品不含有H6亚型的禽流感病毒或候选不含有H6亚型的禽流感病毒； 如果所述PCR产物中含有249bp和164bp的DNA片段，所述待测样品含有N1亚型的禽流 感病毒或候选含有N1亚型的禽流感病毒；如果所述PCR产物中不含有249bp的DNA片段， 所述待测样品不含有N1亚型的禽流感病毒或候选不含有N1亚型的禽流感病毒；如果所述 PCR产物中含有164bp的DNA片段，所述待测样品含有禽流感病毒或候选含有禽流感病毒； 如果所述PCR产物中不含有164bp的DNA片段，所述待测样品不含禽流感病毒或候选不含 禽流感病毒。
[0051] 上述系统中，H1)的PCR体系中，每25yLPCR反应体系可含有：25mM MgCl22.5yL，10Xbuffer2.5yL，10mMdNTPl.OyL，引物（SEQIDNo.l的第 19-38 位核 苷酸所示的单链DNA，SEQIDNo. 2的第20-39位核苷酸所示的单链DNA，SEQIDNo. 3的 第19-38位核苷酸所示的单链DNA，SEQIDNo. 4的第20-38位核苷酸所示的单链DNA，SEQ IDNo. 5的第19-38位核苷酸所示的单链DNA和SEQIDNo. 6的第20-39位核苷酸所示的 单链DNA)，DNAPolymerase0. 5yL，浓度为10ng/yL的待测病毒核酸1yL，以无菌的超 纯水补足25yL，使各条引物的终浓度均为1yM。所述PCR的反应程序如下：50°C30min， 94°C2min;94°C30s，50-6(TC30s，72°C30s，30 个循环；72°C10min。
[0052] 上述系统中，HI)的PCR体系中，每25yLPCR反应体系可含有：25mM MgCl22.5yL，10Xbuffer2.5yL，10mMdNTP1.0yL，SEQIDNo.l所示的单链DNA，SEQID No. 3所示的单链DNA，SEQIDNo. 5所示的单链DNA，SEQIDNo. 2所示的单链DNA，SEQID No. 4所示的单链DNA，SEQIDNo. 6所示的单链DNA，SEQIDNo. 1的第1-18位核苷酸所示 的单链DNA，SEQIDNo. 2的第1-19位核苷酸所示的单链DNA，DNAPolymerase0.5yL，浓 度为10ng/yL的待测病毒核酸lyL，以无菌的超纯水补足25yL，使SEQIDNo. 1、2、3、4、5 和6所示单链DNA的终浓度均为1yM，SEQIDNo. 1的第1-18位核苷酸所示的单链DNA和 SEQIDNo. 2的第1-19位核苷酸所示的单链DNA的终浓度均为10yM。所述PCR的反应程 序如下：95°C预变性 10min;95°C30s，50°C30s，72°Clmin，10 个循环；95°C30s，60°C30s， 72°Clmin，10 个循环；95°C30s，50°C30s，72°Clmin，20 个循环；72°C延伸lOmin;4°C终止。
[0053] 上述系统中，所述I还包括记载有下述II)和12)的载体：
[0054] II)在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的核酸（DNA或RNA或以RNA为模 板转录得到的cDNA)为模板，用所述成套引物2进行PCR扩增得到PCR产物；
[0055] 12)检测步骤II)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有194bp和 164bp的DNA片段，所述待测样品含有H6亚型的禽流感病毒或候选含有H6亚型的禽流感病 毒；如果所述PCR产物中不含有194bp的DNA片段，所述待测样品不含有H6亚型的禽流感 病毒或候选不含有H6亚型的禽流感病毒；如果所述PCR产物中含有164bp的D