，其他步骤均不变，利用GenomeLab GeXP遗传分析系统分析步骤1得到的成套引 物的PCR产物。
[0156] 结果显示，H6N1亚型禽流感病毒的成套引物的PCR产物中含有194bp的目的峰、 249bp的目的峰和164bp的目的峰（图1) ;H6N2亚型、H6N5亚型、H6N6亚型和H6N8亚 型禽流感病毒的成套引物的PCR产物中含有194bp的目的峰和164bp的目的峰（图2); H1N1亚型和H5N1亚型禽流感病毒的成套引物的PCR产物中含有249bp的目的峰和164bp 的目的峰（图3) ;H2N3亚型、H3N2亚型、H4N5亚型、H7N2亚型、H8N4亚型、H9N2亚型、 H10N3亚型、H11N9亚型、H12N5亚型和H13N5亚型禽流感病毒的成套引物的PCR产物中 均只含有164bp的目的峰（图4) ;10株新城疫病毒（F48E9株、Mukteswar株、C3Q株、V4 株、Ulster株、Losota、GX1/00、GX2/00、GX6/02和GX7/02)、8株传染性支气管炎病毒毒株 (Massachussetts41、Connecticut(Conn)、Arkansas(Ark)、Delaware(DE/2686/92)、PA、 JMK、H52和广西分尚株GXIB/02)和5株传染性喉气管炎病毒毒株（北京株、台湾疫苗株、 美国标准株、以色列疫苗株和广西分离株）及阴性对照均无任何扩增产物。结果表明，实 施例1的鉴定或辅助鉴定禽流感病毒（AIV)的成套引物可用来鉴定禽流感病毒及其HA亚 型和NA亚型：PCR产物中若有大小分别为194bp、249bp和164bp的目的峰，表明该病毒为 H6N1亚型禽流感病毒；PCR产物中若只有大小分别为194bp和164bp的目的峰，表明该病毒 为H6Ny(y辛1)亚型禽流感病毒；PCR产物中若只有大小分别为249bp和164bp的目的峰， 表明该病毒为HxNl(x辛6)亚型禽流感病毒；PCR产物中若仅有大小为164bp的目的峰，表 明该病毒为HxNy(X#6，y辛1)亚型禽流感病毒；PCR产物中若无任何目的峰，表明该病毒 非禽流感病毒。该实验结果说明实施例1的鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的成套引物能特异 性地检测H6N1亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒和N1亚型禽流感病毒。
[0157] 实施例3、实施例1的鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的成套引物的灵敏度性实验
[0158] 1、重组载体的构建
[0159] 以实施例2的H6N1亚型禽流感病毒的cDNA为模板，用实施例1的引物对H6进行 PCR扩增，将得到的PCR产物连接至pGEM-TEasyVector(为Promega公司产品）上，得到 重组载体，将含有引物对H6的靶序列的重组载体命名为H6-T。
[0160] 按照上述方法，将"引物对H6"替换为"引物对N1"，其他步骤均不变，得到含有引 物对N1的靶序列的重组载体N1-T。
[0161] 按照上述方法，将"引物对H6"替换为"引物对M"，其他步骤均不变，得到含有引物 对M的靶序列的重组载体M-T。
[0162] 2、引物对H6的灵敏度
[0163] 将步骤1的册-1'用无菌水稀释为浓度梯度分别为107、10 6、105、104、103、102和10 1 拷贝/UL的H6-T溶液。
[0164] 按照实施例2步骤二中1的方法，将"实施例1的引物对M"替换为"实施例1的 弓丨物对H6"，并将"步骤一得到的病毒的cDNA或DNA"分别替换为上述浓度梯度分别为107、 106、105、104、103、102和10 1拷贝/yL的H6-T溶液，其他步骤均不变，分别得到H6的107PCR 产物、H6的106PCR产物、H6的105PCR产物、H6的104PCR产物、H6的103PCR产物、H6的 102PCR产物和H6的10中〇?产物。
[0165] 按照实施例2步骤二中2的方法，将"引物对M的PCR产物"分别替换为上述H6的 107PCR产物、H6 的 106PCR产物、H6 的 105PCR产物、H6 的 104PCR产物、H6 的 103PCR产物、H6 的102PCR产物和H6的K^PCR产物，其他步骤均不变，利用GenomeLabGeXP遗传分析系统 分析上述得到的引物对H6的PCR产物。
[0166] 结果表明，H6的107PCR产物、H6的106PCR产物、H6的105PCR产物、H6的104PCR 产物、H6的103PCR产物和H6的102PCR产物中均有194bp的目的峰，表明，引物对H6最低 能检测到浓度为1〇2拷贝/25yL的H6亚型禽流感病毒。
[0167] 3、引物对N1的灵敏度
[0168] 将步骤1的附-1'用无菌水稀释为浓度梯度分别为107、106、10 5、104、103、102和101 拷贝/UL的N1-T溶液。
[0169] 按照实施例2步骤二中1的方法，将"实施例1的引物对M"替换为"实施例1的 引物对N1"，并将"步骤一得到的病毒的cDNA或DNA"分别替换为上述浓度梯度分别为107、 106、10 5、104、103、102和10 1拷贝/yL的N1-T溶液，其他步骤均不变，分别得到N1的107PCR 产物、N1的106PCR产物、N1的105PCR产物、N1的104PCR产物、N1的103PCR产物、N1的 102PCR产物和N1的10中〇?产物。
[0170] 按照实施例2步骤二中2的方法，将"引物对M的PCR产物"分别替换为上述N1的 107PCR产物、N1 的 106PCR产物、N1 的 105PCR产物、N1 的 104PCR产物、N1 的 103PCR产物、N1 的102PCR产物和N1的K^PCR产物，其他步骤均不变，利用GenomeLabGeXP遗传分析系统 分析上述得到的引物对N1的PCR产物。
[0171] 结果表明，N1的107PCR产物、N1的106PCR产物、N1的105PCR产物、N1的104PCR 产物、N1的103PCR产物和N1的102PCR产物中均有249bp的目的峰，表明，引物对N1最低 能检测到浓度为1〇2拷贝/25yL的N1亚型禽流感病毒。
[0172] 4、引物对M的灵敏度
[0173] 将步骤1的11'用无菌水稀释为浓度梯度分别为107、106、10 5、104、103、102和101 拷贝/UL的M-T溶液。
[0174] 按照实施例2步骤二中1的方法，将"步骤一得到的病毒的cDNA或DNA"分别替换 为上述浓度梯度分别为1〇7、1〇6、1〇 5、1〇4、1〇3、1〇2和10 1拷贝/yL的M-T溶液，其他步骤均 不变，分别得到M的107PCR产物、M的106PCR产物、M的105PCR产物、M的104PCR产物、M的 103PCR产物、M的102PCR产物和M的K^PCR产物。
[0175] 按照实施例2步骤二中2的方法，将"引物对M的PCR产物"分别替换为上述M的 107PCR产物、M的106PCR产物、M的105PCR产物、M的104PCR产物、M的103PCR产物、M的 102PCR产物和M的lOtCR产物，其他步骤均不变，利用GenomeLabGeXP遗传分析系统分析 上述得到的引物对M的PCR产物。
[0176] 结果表明，M的107PCR产物、M的106PCR产物、M的105PCR产物、M的104PCR产物、 M的103PCR产物和M的102PCR产物中均有164bp的目的峰，表明，引物对M最低能检测到 浓度为1〇2拷贝/25yL的禽流感病毒。
[0177] 5、成套引物的灵敏度
[0178] 将步骤1的H6-T、N1-T和M-T等摩尔浓度混合后用无菌水进行稀释，得到H6-T、 N1-T和M-T的浓度均为106拷贝/yL的质粒混合液、H6-T、N1-T和M-T的浓度均为10 5拷 贝/UL的质粒混合液、H6-T、N1-T和M-T的浓度均为104拷贝/yL的质粒混合液、H6-T、 N1-T和M-T的浓度均为103拷贝/yL的质粒混合液、H6-T、N1-T和M-T的浓度均为10 2拷 贝/UL的质粒混合液和H6-T、N1-T和M-T的浓度均为101拷贝/yL的质粒混合液。
[0179] 按照实施例2步骤五中1的方法，将"步骤一得到的病毒的cDNA或DNA"分别替换 为上述H6-T、N1-T和M-T的浓度均为10 6拷贝/ y L的质粒混合液、H6-T、N1-T和M-T的浓 度均为1〇5拷贝/ u L的质粒混合液、H6-T、N1-T和M-T的浓度均为10 4拷贝/ y L的质粒混 合液、H6-T、N1-T和M-T的浓度均为103拷贝/ y L的质粒混合液、H6-T、N1-T和M-T的浓度 均为1〇2拷贝/ u L的质粒混合液和H6-T、N1-T和M-T的浓度均为10 1拷贝/ y L的质粒混 合液，其他步骤均不变，分别得到l〇6PCR产物、105PCR产物、10 4PCR产物、103PCR产物、102PCR 产物和K^PCR产物。
[0180] 按照实施例2步骤二中2的方法，将"引物对M的PCR产物"分别替换为上述106PCR 产物、105PCR产物、104PCR产物、103PCR产物、102PCR产物和lOtCR产物，其他步骤均不变， 利用GenomeLabGeXP遗传分析系统分析上述得到的各PCR产物。
[0181] 结果表明，106PCR产物、105PCR产物、104PCR产物、103PCR产物和102PCR产物中均 有大小分别为194bp、249bp和164bp的目的峰，表明，实施例1的鉴定或辅助鉴定禽流感病 毒的成套引物最低能检测到的H6N1亚型禽流感病毒的浓度为102拷贝/25yL。
【主权项】
1. 鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的成套引物，为成套引物1、成套引物2、成套引物3或成 套引物4; 所述成套引物1包括名称为册的PCR引物对、名称为N1的PCR引物对和名称为M的 PCR引物对； 所述册由册-F和册-R组成；所述册-F为包含序列表中SEQ ID No. 1的第19-38位 核巧酸的单链DNA ;所述册-R为包含序列表中SEQ ID No. 2的第20-39位核巧酸的单链 DNA ； 所述N1由N1-F和N1-R组成；所述N1-F为包含序列表中SEQ ID No. 3的第19-38位 核巧酸的单链DNA ;所述N1-R为包含序列表中SEQ ID No. 4的第20-38位核巧酸的单链 DNA ； 所述M由M-F和M-R组成；所述M-F为包含序列表中SEQ ID No. 5的第19-38位核巧 酸的单链DNA ;所述M-R为包含序列表中SEQ ID No. 6的第20-39位核巧酸的单链DNA ; 所述成套引物2包括所述册和所述M ; 所述成套引物3包括所述N1和所述M ; 所述成套引物4包括所述册和所述N1。
2. 根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：所述册由序列表中SEQ ID No. 1所 示的单链DM和SEQ ID No. 2所示的单链DM组成；所述N1由序列表中SEQ ID No. 3所示 的单链DNA和SEQ ID No. 4所示的单链DNA组成；所述M由序列表中SEQ ID No. 5所示的 单链DNA和SEQ ID No. 6所示的单链DNA组成。
3. 根据权利要求1或2所述的成套引物，其特征在于；所述成套引物1、所述成套引物 2、所述成套引物3和所述成套引物4均还包括引物对G;所述G由序列表中SEQ ID No. 1 的第1-18位核巧酸所示的单链DNA和SEQ ID No. 2的第1-19位核巧酸所示的单链DNA组 成。 4. PCR引物对，为鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的PCR引物对、鉴定或辅助鉴定册亚型禽 流感病毒的引物对或鉴定或辅助鉴定N1亚型禽流感病毒的引物对，其特征在于：所述鉴定 或辅助鉴定禽流感病毒的PCR引物对为权利要求1或2所述的M ;所述鉴定或辅助鉴定册 亚型禽流感病毒的引物对为权利要求1或2所述的册；所述鉴定或辅助鉴定N1亚型禽流 感病毒的引物对为权利要求1或2所述的N1。
5. 鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的成套引物，由权利要求1或2所述的M和权利要求3 所述的G组成。
6. 鉴定或辅助鉴定册亚型禽流感病毒的成套引物，由权利要求1或2所述的册和权 利要求3所述的G组成。
7. 鉴定或辅助鉴定N1亚型禽流感病毒的成套引物，由权利要求1或2所述的N1和权 利要求3所述的G组成。
8. 鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的系统，其特征在于：所述系统含有权利要求1或2或3 或5或6或7所述的成套引物或权利要求4所述的PCR引物对。
9. 权利要求1或2或3或5或6或7所述的成套引物的制备方法，包括将权利要求1 或2或3或5或6或7所述的成套引物中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步 骤。
10.权利要求4所述的PCR引物的制备方法，包括将权利要求4所述的PCR引物对中的 所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
【专利摘要】本发明公开了禽流感病毒及其H6亚型和N1亚型的GeXP快速检测试剂盒。本发明所提供的GeXP快速检测试剂盒包括成套引物1、成套引物2、成套引物3或成套引物4；成套引物1包括H6、N1和M；成套引物2包括H6和M；成套引物3包括N1和M；成套引物4包括H6和N1；H6由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的所示的单链DNA组成；N1由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的单链DNA组成；M由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的单链DNA组成。实验证明，本发明的成套引物可用来鉴定禽流感病毒及其H6亚型和N1亚型。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-10, C12R1-93, C12Q1-70, C12N15-11
【公开号】CN104531899
【申请号】CN201410827498
【发明人】谢芝勋, 罗思思, 谢志勤, 邓显文, 刘加波, 谢丽基, 黄莉, 黄娇玲, 曾婷婷
【申请人】广西壮族自治区兽医研究所
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月26日