表达h5亚型禽流感病毒截短ha蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达H5亚型禽流感病毒截短HA蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法，所述的耐热疫苗株分类命名为rTS?HA1/H5，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V201629。该疫苗株具有显著的耐热特性，可极大降低对冷链系统的依赖，节省保存运输成本和提高疫苗热稳定性。该疫苗株表达的不是完整的HA蛋白，只选取了HA蛋白中具有强免疫原性的HA1区域(1?1041nt)，可针对性地增强疫苗的免疫保护效果。可用于制备H5禽流感、新城疫二联耐热活疫苗。CCTCC NO: V20162920160419
【专利说明】
表达H5亚型禽流感病毒截短HA蛋白的重组新城疫耐热疫苗株 及制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种表达H5亚型禽流感病毒截短HA蛋白的 重组新城疫耐热疫苗株及制备方法。
【背景技术】
[0002] H5亚型禽流感病毒可引发禽类的急性致死性传染病一高致病性禽流感，其临床表 现为高死亡率、产蛋下降，严重的呼吸道症状等。H5亚型禽流感还可感染人类，并引起发病。 1997年香港的"禽流感"事件中，H5亚型禽流感跨越种间障碍直接感染人类，造成了 18人感 染、6人死亡。截止2013年，H5亚型禽流感已经导致648人感染，384人死亡，其中我国45人感 染，30人死亡。除家禽外，我国从水禽、野鸟及其它野生动物中也分离到了 H5亚型禽流感毒 株。近年来，H5亚型禽流感给全球养禽业造成了巨大经济损失的同时，也对人类健康和全球 公共卫生构成严重威胁。
[0003] 预防接种灭活疫苗是我国当前防控H5亚型禽流感的主要手段。传统的灭活疫苗制 备比较简单，储存运输方便，免疫效果持久，在禽流感防控中发挥了重要作用。但灭活疫苗 也有一些不足之处，如需肌肉注射，费工费时，免疫成本高。灭活疫苗的使用在一定程度上 增加了临床上区分野毒感染与疫苗免疫的难度，且存在散毒风险。因此，研发廉价、安全、高 效的H5亚型禽流感疫苗具有重要的现实意义。
[0004] 随着分子生物学技术的不断进步，新型基因工程疫苗的研发不断取得突破，其中 基于新城疫病毒载体的新型多联活疫苗是研发热点之一，许多病原的免疫原性基因已经在 新城疫载体内成功表达，并取得了较好的免疫保护效果，如传染性法氏囊病毒的VP2蛋白、 H5亚型禽流感病毒的HA蛋白、狂犬病毒的G糖蛋白、严重急性呼吸综合征病毒的CoV蛋白、人 类免疫缺陷病毒的Gag蛋白等。此类疫苗具有可诱导全身性免疫(体液免疫、细胞免疫和粘 膜免疫）、高鸡胚生长特性、生产成本低廉、免疫方式简便(饮水、气雾、点眼/滴鼻等方式）、 安全(毒株间发生重组及毒力返强可能性极小)等优点。但现有的新城疫病毒载体疫苗均是 以非耐热型新城疫病毒为骨架构建的。
[0005] 现有已经上市的H5禽流感、新城疫二联疫苗均是将H5亚型禽流感病毒株和新城疫 病毒株灭活后制备而成的，其主要原因是由于H5亚型禽流感病毒具有一定的致病性，不能 用于制备活疫苗。此类疫苗的缺点是需肌肉注射，费工费时，免疫成本高。灭活疫苗的使用 在一定程度上增加了临床上区分野毒感染与疫苗免疫的难度，且存在散毒风险。
[0006] 专利申请号为"CN200680000024.0"的文献公开了表达禽流感病毒H5亚型HA蛋白 的重组新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株。该疫苗株不具备显著的耐热特性，且表达的是完整 的HA蛋白。
[0007] 因此，如何提供一种具有耐热、稳定性强、冷藏条件要求低的表达H5亚型禽流感病 毒截短HA蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法是本领域技术人员亟待解决的技术问 题。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术中的不足，本发明进行了深入研究，提供了一种表达H5亚型禽流感 病毒截短HA蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法。
[0009] 本发明一方面涉及一种表达H5亚型禽流感病毒截短HA蛋白的重组新城疫耐热疫 苗株，其特征在于所述的耐热疫苗株分类命名为rTS-HAl/H5,于2016年4月19日保藏于武汉 大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:V201629。
[0010] 本发明另一方面还涉及表达H5亚型禽流感病毒截短HA蛋白的重组新城疫耐热疫 苗株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
[0011] 1.1 H5亚型禽流感病毒HA1基因的PCR扩增
[0012] 将H5N1禽流感病毒A/chicken/Hubei/489/2004株在9-11日龄鸡胚上进行增殖，接 种5天后收获鸡胚尿囊液。将收获的尿囊液进行HA1基因的RT-PCR扩增，扩增引物为:上游引 物SY-AAGCTTGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGd，下游引物57-ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATCCTCTCTTTTTTCTTCTTCTC-3';对PCR产 物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接；
[0013] 1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增
[0014]以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5Y-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTC-3 7，下游引物57 -CATGGTGGCAAGCTTTCTACCCGTATTTTTTCTTAATCCTTAATATAGCTG-3';扩增模板为新城疫病毒耐 热株质粒PTS09-C;琼脂糖凝胶电泳检测目的条带约18kb，与预期的17.8kb大小相符;对PCR 产物进行回收纯化，测定其浓度，待克隆连接；
[0015] 1.3重组质粒PTS-HA1/H5的克隆连接
[0016]采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的HA1基因片段和耐热载体片段进行克隆 连接，连接序列为AAGCTTGCCACCATG和TCGGAGTGCCCCGAT;连接产物转化DH5a感受态细胞，转 化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养;对菌液进行HA1基因的PCR鉴 定;鉴定为阳性的菌液进行质粒提取，得到重组质粒PTS-HA1/H5;
[0017] 1.4重组病毒rTS-HAl/H5的拯救恢复
[0018] 采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒pT S-HA1 /H5与三个分别表达NP、P和L蛋 白的辅助质粒共转染ΒΗΚ-21细胞;转染后72小时，反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄SPF 鸡胚;接种后5天，收获鸡胚尿囊液，分离得到表达Η5亚型禽流感病毒截短ΗΑ蛋白的重组新 城疫耐热疫苗株。
[0019] 本发明还涉及上述表达Η5亚型禽流感病毒截短ΗΑ蛋白的重组新城疫耐热疫苗株 在制备重组病毒中的应用。
[0020] 本发明还涉及上述表达Η5亚型禽流感病毒截短ΗΑ蛋白的重组新城疫耐热疫苗株 在制备Η5禽流感、新城疫二联耐热活疫苗中的应用。
[0021] 本申请公开了一种可表达Η5亚型禽流感病毒截短ΗΑ蛋白的重组新城疫病毒耐热 株。该疫苗株具有显著的耐热特性，可极大降低对冷链系统的依赖，节省保存运输成本和提 高疫苗热稳定性。该疫苗株表达的不是完整的ΗΑ蛋白，只选取了ΗΑ蛋白中具有强免疫原性 的ΗΑ1区域（l-1041nt)，可针对性地增强疫苗的免疫保护效果。可用于制备Η5禽流感、新城 疫二联耐热活疫苗。
【附图说明】
[0022]图1为本发明表达H5亚型禽流感病毒截短HA蛋白的重组耐热新城疫病毒全长质粒 的构建示意图。其中rTS09-C为亲本株的基因组结构，rTS-HAl/H5为在rTS09-C基因组中插 入了H5亚型禽流感病毒HA1蛋白后的结构，详细标注了插入序列的整体序列组成。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均在本发明的保护范围内。 [0024] 实施例1
[0025] 第一步、重组全长质粒pTS-HAl/H5的构建与鉴定
[0026] 1.1 H5亚型禽流感病毒HA1基因的PCR扩增
[0027] 将H5N1禽流感病毒A/chicken/Hubei/489/2004株（该病毒株已有文献报道，罗孟 成，H5N1亚型禽流感病毒核蛋白NP的原核表达及抗体制备，中国人兽共患病学报，2008)在 9-11日龄鸡胚上进行增殖，接种5天后收获鸡胚尿囊液。将收获的尿囊液进行HA1基因的RT-PCR扩增，扩增引物为：上游引物5' -AAGCTTGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGC-37，下游 引物5' - ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATCCTCTCTTTTTTCTTCTTCTC-3 7 (下划线部分为用于In-fusion克隆连接的互补序列）。琼脂糖凝胶电泳检测目的条带约 l.lkb，与预期的1096bp相符(HA1基因长度为1041bp，分别在HA1基因前端和后端引入了基 因起始序列和基因终止序列，同时在HA1基因前端引入了Kozak序列）。对PCR产物进行琼脂 糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接。
[0028] 1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增
[0029] 以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5Y-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTC-3 7，下游引 物57-CATGGTGGCAAGCTTTCTACCCGTATTTTTTCTTAATCCTTAATATAGCTG-3 7 (下划线部分为用于In-fusion克隆连接的互补序列）。扩增模板为新城疫病毒耐热株质粒pTS09-C。琼脂糖凝胶电 泳检测目的条带约18kb，与预期的17.8kb大小相符。对PCR产物进行回收纯化，测定其浓度， 待克隆连接。
[0030] 1.3重组质粒PTS-HA1/H5的克隆连接
[0031]按照图1所示的方式，采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的HA1基因片段和耐 热载体片段进行克隆连接(连接序列为AAGCTTGCCACCATG和TCGGAGTGCCCCGAT)。连接产物转 化DH5a感受态细胞，转化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养。对菌 液进行HA1基因的PCR鉴定。鉴定为阳性的菌液进行质粒提取，得到重组质粒pTS-HAl/H5,待 酶切和测序鉴定。
[0032] 1.4重组质粒pTS-HAl/H5的酶切与测序鉴定
[0033]分别以BamHI和Mlul内切酶对全长重组质粒进行酶切鉴定，均得到了与预期相符 的酶切图谱。将酶切鉴定正确的重组质粒PTS-HA1/H5送至测序公司进行序列测定，结果表 明H5亚型禽流感的HA1基因插入到了新城疫病毒耐热载体的P和Μ基因之间，且所有序列与 预期完全一致，重组质粒PTS-HA1/H5构建成功。
[0034] 第二步、重组病毒rTS-HAl/H5拯救恢复与鉴定
[0035] 2.1重组病毒rTS-HAl/H5的拯救恢复
[0036]采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒pT S-HA1 /H5与三个分别表达NP、P和L蛋 白的辅助质粒共转染ΒΗΚ-21细胞(已预感染表达T7RNA聚合酶的痘苗病毒）。转染后72小时， 反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄SPF鸡胚。接种后5天，收获鸡胚尿囊液，待进行新城疫 病毒检测。
[0037] 2.2重组病毒的血凝效价和荧光定量PCR检测
[0038] 以血凝试验和荧光定量PCR的方法，对收获鸡胚尿囊液进行检测，结果均为新城疫 阳性。初步表明重组病毒rTS-HAl/H5拯救成功。
[0039] 2.3重组病毒HA1基因的PCR扩增与测序
[0040] 应用H5亚型禽流感病毒HA1基因的特异性扩增引物，对重组病毒rTS-HAl/H5的HA1 基因进行RT-PCR扩增（扩增引物为5' -CCATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGC-3' -TTATTATCCTCTCTTTTTTCTTCTTCTC-3')，对PCR扩增产物进行序列测定分析，得到1096bp长的 HA1基因序列（SEQ ID No.l)，从5'到3'端，依次包含了P基因的部分非编码区序列(UTR)、P 基因的基因终止序列(GE)、中间序列（IG)、HA1基因的基因起始序列(GS)、Kozak序列、HA1基 因序列、HA1基因的双重终止密码子、HA1基因的GE序列、IG序列、Μ基因的GS序列和Μ基因的 UTR序列。与预期序列100 %-致。
[0041 ] 第三步、Η5亚型禽流感病毒截短ΗΑ蛋白在重组病毒rTS-HAl/H5中的表达验证
[0042] 3.1间接免疫荧光法检测截短HA蛋白的表达
[0043] 将重组病毒rTS-HAl/H5和rTS09-C(对照）分别以0.01M0I感染BHK-21细胞，24h后 进行间接免疫荧光检测，一抗为NDV阳性鸡血清或H5亚型禽流感阳性血清。检测结果表明， 重组病毒rTS-HAl/H5感染的细胞内，使用NDV阳性鸡血清或H5亚型禽流感阳性血清作为一 抗时均能检测到绿色荧光，而rTS09-C株感染的细胞只在NDV阳性血清作用下检测到荧光。
[0044] 3.2 Western Blot法检测截短HA蛋白的表达
[0045] 将重组病毒rTS-HAl/H5和rTS09-C(对照）分别以0.01M0I感染BHK-21细胞，24h后 收集细胞裂解液，以H5亚型禽流感阳性鸡血清为一抗进行Western Blot检测。检测结果表 明，在40KDa附近出现一条明显的目的条带，与预期的39.2KDa大小相近。表明HA1蛋白在重 组病毒感染的细胞内正确表达。
[0046] 第四步、重组病毒rTS-HAl/H5的生物学特性鉴定
[0047] 4.1重组病毒的增殖特性测定
[0048] 为比较重组病毒rTS-HAl/H5株与亲本rTS09-C株的生长增殖情况，将两株病毒分 别以100TCID5q接种BHK-21细胞，接种后24h、48h、72h、96h取上清500μ1，测定病毒TCID 5q，绘 制病毒的生长曲线。结果表明，重组病毒rTS-HAl/H5株和亲本rTS09-C株在BHK-21细胞的生 长曲线相似，增殖滴度相近，约为10 7· WciDso/ml。
[0049] 4.2重组病毒的致病性测定
[0050] 测定重组病毒对鸡胚的最小致死剂量的平均致死时间（MDT/MLD)，结果显示不同 稀释度（ΠΓ1至10-9)的病毒接种鸡胚后的120h内均不会对鸡胚致死，重组病毒rTS-HAl/H5 的MDT/MLD大于120h，表明重组病毒保持了亲本株的低毒特性，外源基因的插入并未改变重 组病毒的致病性。
[0051 ] 4.3重组病毒的耐热特性测定
[0052] 测定重组病毒在56°C环境下的HA耐热特性，同时设置非耐热株LaSota株和耐热株 rTS09-C株为对照。如表1所示，非耐热株LaSota在56°C耐热处理9min后，HA效价降为0,亲本 株rTS09-C和重组病毒rTS-HAl/H5在56°C耐热处理150min后仍具有血凝活性。表明重组病 毒rTS-HAl/H5的耐热特性与亲本株一致，均为耐热株(该病毒株已经保藏，保藏在武汉大学 中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:V201629)。
[0053]表1.重组病毒的HA耐热特性测定结果
[0055] a表示病毒具有血凝活性，|3表示病毒没有血凝活性
[0056] 以上所述实施例只是本发明的较佳实例，而没有限制本发明的实施范围。因此，凡 是根据本
【发明内容】
的实质所作出的等效修改，都应属于在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 表达H5亚型禽流感病毒截短HA蛋白的重组新城疫耐热疫苗株，其特征在于所述的耐 热疫苗株分类命名为rTS-HAl/H5，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏 中心，保藏号为CCTCC N0:V201629。2. 表达H5亚型禽流感病毒截短HA蛋白的重组新城疫耐热疫苗株的制备方法，其特征在 于包括如下步骤： 1. 1H5亚型禽流感病毒HAl基因的PCR扩增 将H5N1禽流感病毒A/chicken/Hubei/489/2004株在9-11日龄鸡胚上进行增殖，接种5 天后收获鸡胚尿囊液;将收获的尿囊液进行HAl基因的RT-PCR扩增，扩增引物为:上游引物 SY-AAGCTTGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGd，下游引物57-ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATCCTCTCTTTTTTCTTCTTCTC-3';对PCR产 物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接； 1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增 以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5'-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTC-3 7，下游引物57 -CATGGTGGCAAGCTTTCTACCCGTATTTTTTCTTAATCCTTAATATAGCTG-3';扩增模板为新城疫病毒耐 热株质粒PTS09-C;对PCR产物进行回收纯化，测定其浓度，待克隆连接； 1.3重组质粒pTS-HAl/H5的克隆连接 采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的HAl基因片段和耐热载体片段进行克隆连 接，连接序列为AAGCTTGCCACCATG和TCGGAGTGCCCCGAT;连接产物转化DH5a感受态细胞，转化 后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养;对菌液进行HAl基因的PCR鉴 定;鉴定为阳性的菌液进行质粒提取，得到重组质粒PTS-HA1/H5; 1.4重组病毒rTS-HAl/H5的拯救恢复 采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒PTS-HA1/H5与三个分别表达NP、P和L蛋白的 辅助质粒共转染BHK-21细胞;转染后72小时，反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄SPF鸡胚； 接种后5天，收获鸡胚尿囊液，分离得到表达H5亚型禽流感病毒截短HA蛋白的重组新城疫耐 热疫苗株。3. 权利要求1所述的表达H5亚型禽流感病毒截短HA蛋白的重组新城疫耐热疫苗株在制 备重组病毒中的应用。4. 权利要求1所述的表达H5亚型禽流感病毒截短HA蛋白的重组新城疫耐热疫苗株在制 备H5禽流感、新城疫二联耐热活疫苗中的应用。
【文档编号】A61P31/16GK105950572SQ201610424946
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】邵华斌, 温国元, 罗青平, 潘兹书, 乔磊, 罗玲, 王红琳, 张腾飞, 汪宏才, 张蓉蓉, 卢琴, 艾地云
【申请人】湖北省农业科学院畜牧兽医研究所