一种高品质噬菌体保存保护剂及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供了一种高品质噬菌体保存保护剂以及该高品质噬菌体保存保护剂的制备和应用方法。其中本发明所述的高品质噬菌体保存保护剂，组分合理，其中脱脂奶粉、白蛋白粉、酵母粉、中性白土等形成整个保存保护剂的骨架，还包含多种糖类和盐，组分合理，原料来源广，易于获得，成本低，并且可以用于多种噬菌体的保存，适应性好。本发明所述的高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，方法合理，工艺简单易行，效率高，应用成本低，操作简单、易于实现。高品质噬菌体保存保护剂具有极高的应用前景，并且使用方便，应用便捷。
【专利说明】
一种高品质噬菌体保存保护剂及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术和微生物制品领域，具体地，涉及一种高品质噬菌体保存保 护剂，以及该高品质噬菌体保存保护剂的制备方法和应用方法。
【背景技术】
[0002] 噬菌体是一类能感染细菌、放线菌、螺旋体等微生物的病毒的总称，对一些细菌具 有高度的专一性，当噬菌体侵染这些细菌时，可在细菌中繁殖并杀死细菌，而它对动植物没 有毒性。随着分子生物学技术的发展，噬菌体已经广泛用于疾病诊断、水处理等多个领域。 由于噬菌体可以将基因插入宿主DNA内的特性，使得它还成为了重要的分子和遗传学研究 工具。利用噬菌体，可以设计很多精巧的实验。
[0003] 然而在上述过程中，都需要对噬菌体进行保存，在噬菌体的保存过程中，往往需要 加入保存保护剂从而保证噬菌体的活性。现有技术中的保护剂常常保存效果差，噬菌体的 保存时间短，存活率低，噬菌体容易被污染，并且必须在低温条件下进行保存，严重制约了 对噬菌体应用的发展。
【发明内容】
[0004] 发明目的：为了克服以上不足，本发明提供了一种高品质噬菌体保存保护剂以及 该高品质噬菌体保存保护剂的制备和应用方法。
[0005] 技术方案:本发明提供了一种高品质噬菌体保存保护剂，以重量组分计，包括以下 组分：
[0006] 脱脂奶粉5-12份
[0007] 白蛋白粉3-5份
[0008] 酵母粉 0.5-1.2份
[0009] 中性白土 0.02-0.1 份 [0010]木炭粉 0.01-0.03份
[0011] 蜂胶 0.02-0.05份
[0012] 乳糖 1-1.8 份
[0013] 麦芽糖0.8-2份
[0014] 硫酸钠 0.2-0.3份 [0015]氯化钙 0.5-1.5份
[0016] 氯化镁 0.3-0.8份
[0017] 磷酸氢二钾0.02-0.3份
[0018] 磷酸二氢钠 0.04-0.15份
[0019] 甘油1-3份
[0020] 司盘-80 0.01-0.08份
[0021] 水 100 份。
[0022] 本发明所述的高品质噬菌体保存保护剂，组分合理，其中脱脂奶粉、白蛋白粉、酵 母粉、中性白土等形成整个保存保护剂的骨架，防止低分子物质的碳化和氧化，同时保护活 性物质不受温度影响，使保护剂形成多孔性、疏松的海绵状物且具有一定的含水量，在冻存 过程中保持原有的构架，从而增加溶解度。此外，多种糖类和盐使噬菌体保持存活状态以及 对水分起缓解作用，并且保持电解质浓度。噬菌体保存保护剂可以使噬菌体低温保存下免 受溶液损伤和冰晶损伤等物理因素的损伤，并且维持噬菌体极高的存活率和活性，使噬菌 体的活动处于半静止或静止状态。此外，保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱 化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时冷冻保护剂可以通过在噬菌 体内外维持一定的摩尔浓度，降低内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损 伤。此外，保护剂还可以在室温条件下用于多种噬菌体的保存，适应性好。
[0023] 进一步的，上述的高品质噬菌体保存保护剂，以重量组分计，还包括0.1-0.5份的 维生素，所述维生素以重量组分计，包括以下组分：
[0024] 维生素 C ^份
[0025] 维生素 E 3-8份
[0026] 维生素 A 0.5-0.8份
[0027] 维生素 B2 0.2-0.5份。
[0028] 通过增加维生素，增加整个保存保护剂的营养成分和抗氧化作用，使噬菌体保持 存活状态以及对水分起缓解作用。
[0029]进一步的，上述的高品质噬菌体保存保护剂，所述甘油为20 % -40 %的甘油。20 % -40 %的甘油流动性好，易于应用。
[0030] 进一步的，上述的高品质噬菌体保存保护剂，所述的水为去离子水或纯化水。去离 子水或纯化水可以保证高品质噬菌体保存保护剂质量稳定、可控。
[0031] 本发明还提供一种高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，包括以下步骤：
[0032] 1)将脱脂奶粉、白蛋白粉、乳糖、麦芽糖、硫酸钠、氯化钙和氯化镁加入到1/2重量 的水中，升温到20_30°C，磁力搅拌混匀后备用；
[0033] 2)将酵母粉、中性白土、木炭粉、蜂胶、磷酸氢二钾和磷酸二氢钠加入至ljl/2重量的 水中，磁力搅拌混匀后备用；
[0034] 3)将步骤1)的混合液加入到步骤2)得到的溶液中混合，磁力搅拌均匀；
[0035] 4)向混合步骤3)的溶液中再滴加甘油和司盘-80，磁力搅拌20-30min;
[0036] 5)调节步骤4)得到的溶液的pH到5.5-7.5后于115-121°C加热灭菌20-30min，得所 述高品质噬菌体保存保护剂。
[0037] 本发明所述的高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，工艺简单易行，效率高，应用 成本低，操作简单、易于实现，应用方便。
[0038] 进一步的，上述的高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，热灭菌液冷却到室温后， 在无菌条件下加入维生素磁力搅拌混匀。后添加维生素，保证维生素的成分不被破坏。 [0039]进一步的，上述的高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，所述搅拌速度为50-200r/min。条件温和，易于实现。
[0040]进一步的，上述的高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，使用稀盐酸和/或氢氧化 钠调节溶液pH。原料来源广，调节十分方便，并且应用成本低。
[0041 ]进一步的，上述的高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，所述室温为15-25°C。条 件温和，易于实现。
[0042] 本发明还提供一种高品质噬菌体保存保护剂的应用方法，所述高品质噬菌体保存 保护剂应用时，噬菌体液与高品质噬菌体保存保护剂按照1:1-2.5的体积比混合均匀，于室 温保存或者真空冷冻干燥后2_7°C进行冻存。高品质噬菌体保存保护剂使用方便，可以用于 多种不同的噬菌体冻存的使用，适应性好，可以于室温或者冷藏保存，对环境温度要求低， 并非要求必须低温才能保存，即便在15-25Γ的室温条件下也可以进行噬菌体的保存，可以 用于多种情况下的保存，具有极高的应用前景。
[0043] 有益效果:与现有技术相比，本发明具有以下优点:本发明所述的高品质噬菌体保 存保护剂，其组分合理，原料来源广，易于获得，成本低，可以维持噬菌体极高的存活率和活 性，并且适应性好。本发明所述的高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，方法合理，工艺简 单易行，效率高，应用成本低，操作简单、易于实现。具有极高的应用前景，对保存温度要求 低，并且使用方便，可以用于多种情况下的保存，应用便捷。
【附图说明】
[0044] 图1为本发明所述使用实施例1-4高品质噬菌体保存保护剂的噬菌体存活率图。
【具体实施方式】
[0045] 下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题， 并不是一种限制。
[0046] 实施例1
[0047] -种高品质噬菌体保存保护剂，以重量组分计，包括以下组分：
[0048]脱脂奶粉5份
[0049] 白蛋白粉3份
[0050] 酵母粉0.5份 [0051 ] 中性白土 0.02份
[0052] 木炭粉0.01份
[0053] 蜂胶 〇.〇2份
[0054] 乳糖1份
[0055] 麦芽糖0.8份 [0056] 硫酸钠0.2份 [0057]氯化钙0.5份 [0058] 氯化镁0.3份 [0059] 磷酸氢二钾0.02份 [0060] 磷酸二氢钠0.04份 [0061 ] 20 % 甘油 1 份
[0062]司盘-80 0.01 份 [0063] 去离子水100份；
[0064]此外，上述的高品质噬菌体保存保护剂，以重量组分计，还包括0.1份的维生素，所 述维生素以重量组分计，包括以下组分：
[0065] 维生素 C 1份
[0066] 维生素 E 3份
[0067] 维生素 A 0.5份 [0068] 维生素 B2 0.2份。
[0069] 上述高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，包括以下步骤：
[0070] 1)将脱脂奶粉、白蛋白粉、乳糖、麦芽糖、硫酸钠、氯化钙和氯化镁加入到1/2重量 的水中，升温到20°C，50r/min的搅拌速度下磁力搅拌混匀后备用；
[0071] 2)将酵母粉、中性白土、木炭粉、蜂胶、磷酸氢二钾和磷酸二氢钠加入到1/2重量的 水中，50r/min的搅拌速度下磁力搅拌混勾后备用；
[0072] 3)将步骤1)的混合液加入到步骤2)得到的溶液中混合，50r/min的搅拌速度下磁 力搅拌均匀；
[0073] 4)向混合步骤3)的溶液中再滴加甘油和司盘-80，50r/min的搅拌速度下磁力搅拌 20min；
[0074] 5)使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节步骤4)得到的溶液的pH到5.5后于115°C加热灭 菌20min，热灭菌液冷却到15°C后，在无菌条件下加入维生素，50r/min的搅拌速度下磁力搅 拌混匀，得所述高品质噬菌体保存保护剂。
[0075] 上述噬菌体保存保护剂用于副溶血弧菌噬菌体的保存，应用时，噬菌体液与高品 质噬菌体保存保护剂按照1:1的体积比混合均匀，真空冷冻干燥后2°C进行冻存。
[0076] 实施例2
[0077] -种高品质噬菌体保存保护剂，以重量组分计，包括以下组分：
[0078]脱脂奶粉12份
[0079] 白蛋白粉5份
[0080] 酵母粉1.2份 [0081 ] 中性白土 0.1份
[0082] 木炭粉0.03份
[0083] 蜂胶 0.05份
[0084] 乳糖1.8份
[0085] 麦芽糖2份 [0086] 硫酸钠0.3份 [0087]氯化钙1.5份 [0088] 氯化镁0.8份 [0089] 磷酸氢二钾0.3份 [0090] 磷酸二氢钠0.15份
[0091] 40 % 甘油 3份
[0092] 司盘-80 0.08份
[0093] 纯化水100份；
[0094] 此外，上述的高品质噬菌体保存保护剂，以重量组分计，还包括0.5份的维生素，所 述维生素以重量组分计，包括以下组分：
[0095] 维生素 C 3份
[0096] 维生素 E 8份
[0097] 维生素 A 0.8份 [0098] 维生素 B2 0.5份。
[0099] 上述高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，包括以下步骤：
[0100] 1)将脱脂奶粉、白蛋白粉、乳糖、麦芽糖、硫酸钠、氯化钙和氯化镁加入到1/2重量 的水中，升温到30°C，200r/min的搅拌速度下磁力搅拌混勾后备用；
[0101] 2)将酵母粉、中性白土、木炭粉、蜂胶、磷酸氢二钾和磷酸二氢钠加入到1/2重量的 水中，200r/min的搅拌速度下磁力搅拌混勾后备用；
[0102] 3)将步骤1)的混合液加入到步骤2)得到的溶液中混合，200r/min的搅拌速度下磁 力搅拌均匀；
[0103] 4)向混合步骤3)的溶液中再滴加甘油和司盘-80,200r/min的搅拌速度下磁力搅 拌30min;
[0104] 5)使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节步骤4)得到的溶液的pH到7.5后于121°C加热灭 菌30min，热灭菌液冷却到25°C后，在无菌条件下加入维生素，200r/min的搅拌速度下磁力 搅拌混匀，得所述高品质噬菌体保存保护剂。
[0105] 上述噬菌体保存保护剂用于大肠杆菌噬菌体的保存，应用时，噬菌体液与高品质 噬菌体保存保护剂按照1:2.5的体积比混合均匀，真空冷冻干燥后7°C进行冻存。
[0106] 实施例3
[0107] -种高品质噬菌体保存保护剂，以重量组分计，包括以下组分：
[0108] 脱脂奶粉8份 [0109]白蛋白粉4份 [0110]酵母粉1份
[0111] 中性白土 0.06份
[0112] 木炭粉〇.〇2份
[0113] 蜂胶 0.03份
[0114] 乳糖1.5份 [0115]麦芽糖1份
[0116] 硫酸钠0.25份
[0117] 氯化钙0.9份
[0118] 氯化镁0.6份
[0119] 磷酸氢二钾0.2份
[0120] 磷酸二氢钠0.1份
[0121] 30%甘油 2份
[0122] 司盘-80 0.016份
[0123] 纯化水100份；
[0124] 此外，上述的高品质噬菌体保存保护剂，以重量组分计，还包括0.3份的维生素，所 述维生素以重量组分计，包括以下组分：
[0125] 维生素 C 2份
[0126] 维生素 E 6份
[0127] 维生素 A 0.7份
[0128] 维生素 B2 0.3份。
[0129] 上述高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，包括以下步骤：
[0130] 1)将脱脂奶粉、白蛋白粉、乳糖、麦芽糖、硫酸钠、氯化钙和氯化镁加入到1/2重量 的水中，升温到25°C，100r/min的搅拌速度下磁力搅拌混勾后备用；
[0131] 2)将酵母粉、中性白土、木炭粉、蜂胶、磷酸氢二钾和磷酸二氢钠加入到1/2重量的 水中，100r/min的搅拌速度下磁力搅拌混勾后备用；
[0132] 3)将步骤1)的混合液加入到步骤2)得到的溶液中混合，1 OOr/min的搅拌速度下磁 力搅拌均匀；
[0133] 4)向混合步骤3)的溶液中再滴加甘油和司盘-80, lOOr/min的搅拌速度下磁力搅 摔25min;
[0134] 5)使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节步骤4)得到的溶液的pH到7后于118°C加热灭菌 25min，热灭菌液冷却到20°C后，在无菌条件下加入维生素，100r/min的搅拌速度下磁力搅 拌混匀，得所述高品质噬菌体保存保护剂。
[0135] 上述噬菌体保存保护剂用于溶藻弧菌噬菌体的保存，应用时，噬菌体液与高品质 噬菌体保存保护剂按照1:2的体积比混合均匀，真空冷冻干燥后4°C进行冻存。
[0136] 实施例4
[0137] -种高品质噬菌体保存保护剂，以重量组分计，包括以下组分：
[0138] 脱脂奶粉5份
[0139] 白蛋白粉3份
[0140] 酵母粉1.2份
[0141] 中性白土 0.1份
[0142] 木炭粉〇.〇2份
[0143] 蜂胶 0.03份
[0144] 乳糖1.8份
[0145] 麦芽糖2份
[0146] 硫酸钠0.2份
[0147] 氯化钙0.5份
[0148] 氯化镁-0.8份
[0149] 磷酸氢二钾0.1份 [0150] 磷酸二氢钠0.04份
[0151] 20%甘油 3份
[0152] 司盘-80 0.08份
[0153] 去离子水100份；
[0154] 此外，上述的高品质噬菌体保存保护剂，以重量组分计，还包括0.2份的维生素，所 述维生素以重量组分计，包括以下组分：
[0155] 维生素 C 3份
[0156] 维生素 E 8份
[0157] 维生素 A 0.5份
[0158] 维生素 B2 0.2份。
[0159] 上述高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，包括以下步骤：
[0160] 1)将脱脂奶粉、白蛋白粉、乳糖、麦芽糖、硫酸钠、氯化钙和氯化镁加入到1/2重量 的水中，升温到30°C，120r/min的搅拌速度下磁力搅拌混勾后备用；
[0161] 2)将酵母粉、中性白土、木炭粉、蜂胶、磷酸氢二钾和磷酸二氢钠加入到1/2重量的 水中，120r/min的搅拌速度下磁力搅拌混勾后备用；
[0162 ] 3)将步骤1)的混合液加入到步骤2)得到的溶液中混合，120r/min的搅拌速度下磁 力搅拌均匀；
[0163] 4)向混合步骤3)的溶液中再滴加甘油和司盘-80,120r/min的搅拌速度下磁力搅 拌20min;
[0164] 5)使用稀盐酸和/或氢氧化钠调节步骤4)得到的溶液的pH到6后于121°C加热灭菌 20min，热灭菌液冷却到25°C后，在无菌条件下加入维生素，120r/min的搅拌速度下磁力搅 拌混匀，得所述高品质噬菌体保存保护剂。
[0165] 上述噬菌体保存保护剂用于分歧杆菌噬菌体的保存，应用时，噬菌体液与高品质 噬菌体保存保护剂按照1:1.5的体积比混合均匀，于20°C保存。
[0166] 对使用实施例1-4的噬菌体保护剂的保存1、3、6、9个月后的噬菌体污染情况以及 存活率分别进行考察，如表1所示，噬菌体均未污染，并且如图1所示，噬菌体在9个月内保持 62.5%以上的存活率。
[0167] 表1噬菌体污染情况
[0168]
[0169]以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种高品质噬菌体保存保护剂，其特征在于：以重量组分计，包括以下组分： 脱脂奶粉5-12份 白蛋白粉3-5份 酵母粉0.5-1.2份 中性白土 0.02-0.1份 木炭粉0.01-0.03份 蜂胶0.02-0.05份 乳糖1-1.8份 麦芽糖0.8-2份 硫酸钠0.2-0.3份 氯化钙0.5-1.5份 氣化儀〇. 3_0.8份 磷酸氢二钾0.02-0.3份 磷酸二氢钠0.04-0.15份 甘油1-3份 司盘-80 0.01-0.08份 水100份。2. 根据权利要求1所述的高品质噬菌体保存保护剂，其特征在于：以重量组分计，还包 括0.1-0.5份的维生素， 所述维生素以重量组分计，包括以下组分： 维生素 C 1-3份 维生素 E 3-8份 维生素 A 0.5-0.8份 维生素 B2 0.2-0.5份。3. 根据权利要求1所述的高品质噬菌体保存保护剂，其特征在于:所述甘油为20%-40% 的甘油。4. 根据权利要求1所述的高品质噬菌体保存保护剂，其特征在于:所述的水为去离子水 或纯化水。5. 根据权利1-4任一项所述的高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，其特征在于:包括 以下步骤： 1) 将脱脂奶粉、白蛋白粉、乳糖、麦芽糖、硫酸钠、氯化钙和氯化镁加入到1/2重量的水 中，升温到20-30°C，磁力搅拌混匀后备用； 2) 将酵母粉、中性白土、木炭粉、蜂胶、磷酸氢二钾和磷酸二氢钠加入到1/2重量的水 中，磁力搅拌混匀后备用； 3) 将步骤1)的混合液加入到步骤2)得到的溶液中混合，磁力搅拌均匀； 4) 向混合步骤3)的溶液中再滴加甘油和司盘-80,磁力搅拌20-30min; 5) 调节步骤4)得到的溶液的pH到5.5-7.5后于115-121°(：加热灭菌2〇-3〇1^11，得所述高 品质嗤囷体保存保护剂。6. 根据权利要求5所述的高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，其特征在于:热灭菌液 冷却到室温后，在无菌条件下加入维生素磁力搅拌混匀。7. 根据权利要求5或6所述的高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，其特征在于:所述 搅拌速度为50_200r/min。8. 根据权利要求5所述的高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，其特征在于:使用稀盐 酸和/或氢氧化钠调节溶液pH。9. 根据权利要求6所述的高品质噬菌体保存保护剂的制备方法，其特征在于:所述室温 为 15-25。。。10. 根据权利要求1或5所述的高品质噬菌体保存保护剂的应用方法，其特征在于:所述 高品质噬菌体保存保护剂应用时，噬菌体液与高品质噬菌体保存保护剂按照1:1-2.5的体 积比混合均匀，于室温保存或者真空冷冻干燥后2-7°C进行冻存。
【文档编号】C12N7/00GK105950569SQ201610416073
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】许维素, 宋增福, 陈彪
【申请人】苏州埃瑞特生物技术有限公司