基于噬菌体抗性选择的用于对食品进行质构化的乳酸细菌的制作方法
【专利说明】基于隘菌体抗性选择的用于对食品进行质构化的乳酸细菌
[0001] 本申请是申请日为2011年1月28日、申请人为科?汉森有限公司、发明名称为"基 于隧菌体抗性选择的用于对食品进行质构化的乳酸细菌"的中国专利申请201180007721.X 的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及具有提高的隧菌体抗性的细菌细胞、包含所述细胞的起子培养物W及 用所述起子培养物发酵的乳制品。
【背景技术】
[0003] 食品工业使用多种细菌、特别是乳酸细菌来改进食品的味道和质构，W及延长运 些食品的保存期。在乳品工业的情况下，广泛使用乳酸细菌来实现乳的酸化(通过发酵），W 及对其所渗入的产品进行质构化。
[0004] 在食品工业使用的乳酸细菌中，可W提到链球菌属（Streptococcus)、乳球菌属 化actococcus)、乳杆菌属化actobacillus)、明串珠菌属化euconostoc)、片球菌属 化ediococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)。广泛地单独使用或与其它细菌组合使用 乳酸菌物种嗜热链球菌（Streptococcus thermophiIus)来生产食品，特别是发酵产品。它 们尤其在用于发酵乳(例如酸奶)生产中的酵素配制中使用。运些乳酸细菌中的某些在发酵 产品的质构的发展中起主要作用。运一特征与多糖的生产息息相关。在嗜热链球菌菌株中， 可W区分质构化与非质构化菌株。
[0005] W02007095958A1公开了具有质构化性质的嗜热链球菌菌株。图1中，可W看到质构 化程度最高的菌株CHCC8833(DSM17876)具有约59化的剪切应力值。
[0006] 为了满足行业要求，提供乳酸细菌，特别是嗜热链球菌的新颖质构化菌株W便对 食品进行质构化已经变得必要。特别需要一种嗜热链球菌的新颖质构化菌株，其可与乳杆 菌属的菌株一起使用。行业的另一个需求是菌株对食品工业中通常发现的隧菌体具有抗 性。
【发明内容】
[0007] 发明人已经提供了一组新颖的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌化actobaci 1 Ius bulgaricus)的乳酸细菌，该组新颖的乳酸细菌对隧菌体攻击的抗性高于其所来源的（母） 菌株。此外，已经意外地发现，当使用细菌对乳进行发酵时，运一组细菌所产生的剪切应力 和/或凝胶硬度要高于母菌株。
[000引令人吃惊的是，抗隧菌体突变株比母菌株产生更多的质构，例如更高的剪切应力 和/或凝胶硬度（当所述菌株用于对乳进行发酵时），且特别令人吃惊的是，在ga化基因中 (还)含有突变(相对于野生型菌株)的菌株的抗隧菌体突变株比母菌株产生更多的质构（当 所述菌株用于对乳进行发酵时）。
[0009]根据W上惊人发现，本发明设及一种通过筛选母菌株的抗隧菌体突变株来制造质 构化乳酸细菌菌株的方法，例如制造质构化乳酸细菌(例如，除了具有例如隧菌体抗性、实 质性隧菌体抗性和/或与母菌株相比具有提高的隧菌体抗性W外，质构化程度也高于母菌 株的细菌)的方法，所述方法包括W下步骤：
[0010] a)提供乳酸细菌菌株(母菌株）；和
[0011] b)分离母菌株的突变株，所述突变株比母菌株耐受更多的隧菌体(例如更多的隧 菌体类型或更多的隧菌体菌株）。
[0012] 此外，本发明设及质构化乳酸细菌菌株，例如嗜热链球菌菌株或保加利亚乳杆菌 菌株，运些菌株经过改造从而比母菌株耐受更多的隧菌体，特别是隧菌体CHPC658、 CHPC1057、CHPC108 巧 PCHPCl 152的其中一种。
【附图说明】
[0013] 图1描绘用StressTech流变仪测量的半乳糖阳性菌株CHCC11342和半乳糖阳性的 抗隧菌体突变株CHCC11977的剪切应力。剪切应力是在37°C在乳中生长过夜后在凝固乳中 测量的。
[0014] 图2描绘用StressTech流变仪测量的CHCC10019的抗隧菌体突变株的剪切应力。剪 切应力是在37°C在乳中生长过夜后在凝固乳中测量的。
[0015] 图3描绘用StressTech流变仪测量的CHCC12339(CHCC9204的抗隧菌体突变株）的 凝胶硬度。凝胶硬度是在37°C在乳中生长过夜后在凝固乳中测量的。
[0016] 图4描绘用StressTech流变仪测量的CHCC13140(CHCC5086的抗隧菌体突变株）的 剪切应力。剪切应力是在37°C在乳中生长过夜后在凝固乳中测量的。
【具体实施方式】
[0017] 在第一方面，本发明设及一种制造乳酸细菌(其具有例如隧菌体抗性、实质性隧菌 体抗性和/或与母菌株相比具有提高的隧菌体抗性，或当使用细菌对乳进行发酵时，所产生 的剪切应力和/或凝胶硬度高于母菌株)的方法，其包括W下步骤：
[0018] a)提供乳酸细菌菌株(母菌株）；和
[0019] b)分离母菌株的突变株，所述突变株比母菌株耐受更多的隧菌体(例如更多的隧 菌体类型或更多的隧菌体菌株），和/或所述突变株针对母菌株无抗性的隧菌体具有抗性 (在相同条件下）。
[0020] 在一个引人关注的方面，本发明设及一种制造乳酸细菌(其具有例如隧菌体抗性、 实质性隧菌体抗性和/或与母菌株相比具有提高的隧菌体抗性，和/或当使用细菌对乳进行 发酵时，所产生的剪切应力和/或凝胶硬度高于母菌株)的方法，其包括W下步骤：
[0021 ] a)提供乳酸细菌菌株(母菌株）；和
[0022] al)使乳酸细菌菌株暴露于隧菌体，例如能够溶解母菌株的隧菌体，例如选自由 CHPC658、CHPC1057、CHPC1089和CHPC1152组成的群组的隧菌体；W及
[0023] b)分离母菌株的突变株，所述突变株对隧菌体具有抗性(或所述菌株没有被隧菌 体溶解）。
[0024] 另外，本发明设及一种方法，其包括W下步骤：
[0025] a)提供乳酸细菌菌株(母菌株）；
[0026] al)使乳酸细菌菌株暴露于隧菌体，例如能够溶解母菌株的隧菌体，例如选自由 CHPC658、CHPC1057、CHPC1089 和 CHPC1152 组成的群组的隧菌体；
[0027] a2)在生长培养基中解育经过暴露的细菌细胞;和
[0028] b)分离母菌株的突变株，所述突变株没有被隧菌体溶解。
[0029] 本发明的方法可W包括步骤
[0030] C)例如在步骤al)之前、期间或之后，使母菌株发生突变(例如通过化学处理或福 射处理，或借助于基因工程技术）。
[0031 ]本发明的任何方法还可W包括步骤
[0032] d)例如在步骤C)之前、期间或之后，或在步骤al)之前、期间或之后，在菌株的ga化 基因或ga化调控序列（例如启动子）中引入突变(例如通过化学处理或福射处理，或借助于 基因工程技术）。
[0033] 在一个引人关注的实施方案中，本发明的方法包括W下步骤：
[0034] -提供乳酸细菌菌株(母菌株）；
[0035] -使母菌株发生突变(例如通过化学处理或福射处理，或借助于基因工程技术）；
[0036] -使获得的乳酸细菌菌株暴露于隧菌体，例如能够溶解母菌株的隧菌体，例如选自 由 CHPC658、CHPC1057、CHPC1089 和 CHPC1152 组成的群组的隧菌体；
[0037] -在生长培养基中解育经过暴露的细菌细胞;和
[0038] -分离母菌株的突变株，所述突变株没有被隧菌体溶解。
[0039] 本发明的方法可W导致在ga化基因的启动子区域中，例如在-10区域(Pribnow盒） 中或在Pr i bnow盒与核糖体结合位点之间的区域中引入突变。
[0040] 此外，本发明的方法也可W导致与母菌株相比，半乳糖发酵活性提高的突变。
[0041 ]所述突变可导致ga化基因的Pr化now盒与核糖体结合位点之间的区域中的一个或 多个核巧酸的取代，例如野生型Pr化now盒下游的序列TTCAGT中的C被选自由A、T和G组成的 群组的核巧酸取代。
[0042] 在另一个实施方案中，所述突变可导致：
[0043] -ga化基因的Pr i bnow盒与核糖体结合位点之间的区域中一个或多个核巧酸的取 代，例如野生型Pr化now盒下游的序列TTCAGT(SEQ ID N0:6)中的C被选自由A、T和G组成的 群组的核巧酸取代;和/或
[0044] -野生型-10区域(TACGAT，沈Q ID N0:7)中的C和G中的一个或两个被独立选自由A 和T组成的群组的核巧酸取代;和/或
[0045] -野生型-10区域(TACGAT，沈Q ID N0:7)中的C被独立选自由A和T组成的群组的核 巧酸取代;和/或
[0046] -野生型-10区域(TACGAT，沈Q ID N0:7)中的〔被!'取代;和/或
[0047] -10区域具有核巧酸序列TATGAT(沈Q ID N0:8)、TATTAT(沈Q ID N0:9)或TACTAT (沈Q ID NO: 10)。
[0048] 应了解本发明的方法中所用的母菌株可W是gal+菌株，优选在37°C在含有2%半 乳糖(半乳糖是作为唯一的碳水化合物加入)的M17中解育16小时之后能够使抑值降低至少 1.0的菌株，所述菌株是W每毫升培养基至少10E4个细胞的量接种。所述菌株的实例是W下 菌株，其中：
[0049] -ga化基因的Pribnow盒与核糖体结合位点之间的区域中的一个或多个核巧酸已 经被取代，例如野生型Pr化now盒下游的序列TTCAGT(SEQ ID N0:6)中的C被选自由A、T和G 组成的群组的核巧酸取代;和/或
[0化0]-野生型-10区域(TACGAT，沈Q ID NO:7)中的C和G中的一个或两个已经被独立选 自由A和T组成的群组的核巧酸取代;和/或
[0051 ]-野生型-10区域(TACGAT，SEQ ID N0:7)中的C已经被独立选自由A和T组成的群 组的核巧酸取代;和/或
[0化2]-野生型-10区域(TACGAT，沈Q ID N0:7)中的C已经被T取代;和/或
[0化3] -10区域具有核巧酸序列TATGAT(沈Q ID N0:8)、TATTAT(沈Q ID N0:9)或TACTAT (SEQ ID NO: 10)。新颖的gal+菌株是本发明的一部分。
[0054] 本发明的方法可W包括一个或多个其它步骤，所述其它步骤选自由W下各项组成 的群组：
[0055] Cl)筛选具有隧菌体抗性的突变株，例如与母菌株相比提高的隧菌体抗性;和
[0056] c2)筛选具有Gal+表型的突变株，例如与母菌株相比提高的半乳糖降解活性。
[0057] 本发明的方法的一个实施方案设及一种制造乳酸细菌的方法，其包括W下步骤：
[0058] -提供乳酸细菌菌株(母菌株）；
[0059] -任选地突变母菌株；
[0060] -使任选突变的母菌株暴露于隧菌体，例如能够溶解母菌株的隧菌体，例如选自由 CHPC658、CHPC1057、CHPC1089 和 CHPC1152 组成的群组的隧菌体；
[0061 ]-任选地在生长培养基中解育经过暴露的细菌细胞;和
[0062] -筛选具有隧菌体抗性的突变株，例如与母菌株相比提高的隧菌体抗性;和/或筛 选具有Gal+表型的突变株，例如与母菌株相比提高的半乳糖降解活性。
[0063] 通过本发明的方法获得的突变株可W是自发突变株、通过利用例如化学处理或福 射处理对母菌株进行诱变而获得的突变株、或借助于基因工程技术获得的突变株。本发明 的一个引人关注的突变株是CHCC6008的突变株，特别是gal+和对CHCP1152具有抗性的突变 株。
[0064] 在本发明的方法的一个实施方案中，突变株具有隧菌体抗性、实质性隧菌体抗性 和/或与母菌株相比具有提高的隧菌体抗性，其中所述隧菌体选自由W下各项组成的群组： 能够溶解母菌株的隧菌体、CHPC658、CHPC1057、CHPC1089和CHPC1152。
[0065] 目前优选的是，细菌（母菌株）选自由W下各项组成的群组的种：乳球菌属 化actococcus spp.)、链球菌属（Streptococcus spp.)(例如嗜热链球菌）、乳杆菌属 (Lactobaci