遗传修饰的噬菌体及其用途
【专利摘要】本发明涉及遗传修饰的噬菌体及其在生产目的生物分子的方法中的用途。
【专利说明】遗传修饰的噬菌体及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及在生物学系统中生产目的生物分子的领域。具体而言，本发明涉及遗传修饰的噬菌体，及其为避免对培养基肉汤和/或细菌裂解物的噬菌体污染的用途。
【背景技术】
[0002]细菌细胞是用于生产生物分子尤其是靶蛋白质的首选系统。除了其它优点之外，细菌系统容易使用并且可以在有限的培养体积中快速生产大量的蛋白质。
[0003]最广泛且经常使用的细菌系统之一是噬菌体T7表达系统。该细菌系统描述于US4, 952，496中。在该系统中，编码靶蛋白的基因被置于T7启动子控制下，并被转化进入到包含整合的λ DE3溶原噬菌体的细菌宿主中，常常是大肠杆菌(E.coli)中。XDE3溶原噬菌体携带着编码处于lacUV5启动子控制下的T7RNA聚合酶的基因。当在包含IPTG的培养基中培养时，T7RNA聚合酶的表达被诱导，并且使得靶蛋白表达。
[0004]由于T7RNA聚合酶基因(T7基因I)被整合到Int基因序列内，λ DE3噬菌体在其进入到溶菌期的能力方面具有缺陷。然而，在一些蛋白质的生产过程中并且在任何其它噬菌体缺乏下观察到细菌裂解，表明DE3噬菌体可以恢复其裂解特性。细菌裂解以及更甚者培养基肉汤中感染性噬菌体的存在很 成问题，因为(i)它使得所生产的靶蛋白在一些应用中诸如例如药物应用中的使用大打折扣，(?)为了去除任何微量噬菌体的去污染过程需要生产线的关闭和培养批次的完全更新，以及(iii)其极大降低重组蛋白的产率。
[0005]使用曬菌体的备选方法也有所描述:
[0006]W003/050240描述了用于在宿主细胞中生产靶蛋白的表达系统，包含使用同源重组所整合的编码T7RNA聚合酶的基因。然而，由于T7RNA聚合酶基因的大小，以及由于同源重组不易于在所有大肠杆菌菌株中进行的事实(如Phue等，Biotechnology andBioengineering，101，831-836，2008 中所提及)，W003/050240 的系统难以实施。因此，携带T7RNA聚合酶整合的转化细胞的数量仍然非常低或者得不到这些细胞。此外，使用同源重组时必需使用选择标记，以筛选包含T7RNA聚合酶基因整合的细菌。该标记对于另外的筛选步骤不是可用的并且对于菌株的最终使用是不希望有的。例如，常常使用的选择标记是抗生素抗性基因，但是推荐在生物药物生产中避免使用这些基因。因此，为了从该菌株中去除抗生素抗性基因需要额外的步骤，并且这不一定能够实现。
[0007]W02008/139153描述了另一表达系统，其中宿主细胞以包含T7RNA聚合酶表达盒的质粒转化。然而，由于使用质粒，宿主细胞必须维持在选择条件下以确保它们仍然包含质粒。此外，质粒会频繁进行重组，这有损表达系统。
[0008]因此，需要生产目的生物分子的新方法，其中，当使用噬菌体时，培养物在生长或者蛋白质生产过程中不被感染性噬菌体污染或者不被无意裂解。
[0009]因此本发明提供遗传修饰的噬菌体，其在培养过程中不会恢复其裂解特性，由此使得目的生物分子的生产中无噬菌体污染。
【发明内容】
[0010]本发明的一个目标是遗传修饰的噬菌体，其中
[0011]-表达系统被插入，
[0012]-S和/或R基因被灭活。
[0013]在本发明的一个实施方案中，Int和/或Xis基因被灭活。
[0014]本发明的另一个目标是遗传修饰的噬菌体，其中
[0015]-表达系统被插入，
[0016]_S、R和/或Q基因被灭活，和
[0017]-1nt和/或Xis基因被灭活。
[0018]在本发明的另一个实施方案中，Rz基因被灭活。
[0019]在本发明的另一个实施方案中，表达系统被插入并且Int基因、Xis基因以及R、S和Rz基因被灭活。
[0020]在本发明的另一个实施方案中，表达系统被插入并且Int基因、Xis基因以及Q、R、S和Rz基因被灭活。
[0021]在本发明的另一个实 施方案中，表达系统是T7表达系统。
[0022]在本发明的另一个实施方案中，噬菌体是λ噬菌体、434噬菌体、phi80噬菌体、phi81噬菌体、HK97噬菌体、P21噬菌体。
[0023]在本发明的另一个实施方案中，如上所述的遗传修饰的噬菌体具有SEQ ID NO: 10的序列。在本发明的另一个实施方案中，如上所述的遗传修饰的噬菌体是噬菌体PlI至P53中之一。
[0024]本发明的另一个目标是包含如上所述的遗传修饰的噬菌体和辅助噬菌体的试剂盒。
[0025]本发明的另一个目标是包含如上所述的遗传修饰的噬菌体的宿主细胞。
[0026]在本发明的一个实施方案中，宿主细胞是肠杆菌(enterobacteria),优选大肠杆菌(E.Coli)，更优选 BL21。
[0027]在本发明的另一个实施方案中，如上所述的宿主细胞还包含基因tonA、galK、araB、araA、1n、ompT、rcsA、hsdR、mrr、endA 和 recA 中的至少一个基因的灭活。
[0028]在本发明的另一个实施方案中，如上所述的宿主细胞包含ccdb基因的插入。
[0029]本发明的另一个目标是包含如上所述的宿主细胞和含ccdA基因的质粒的试剂盒。
[0030]本发明的另一个目标是用于制备如上所述的宿主细胞的方法，包括以如上所述的遗传修饰的噬菌体感染宿主细胞。
[0031]本发明的另一个目标是用于生产目的生物分子的方法，包括
[0032]-培养包含根据权利要求1至7任一项的遗传修饰的噬菌体和目的生物分子的核酸序列的宿主细胞，
[0033]-收集所述目的生物分子。
【具体实施方式】
[0034]本发明涉及遗传修饰的噬菌体，其中噬菌体恢复其裂解特性的能力被限制。[0035]发明人致力于对噬菌体的遗传修饰。令人意外的是，发明人证明，不可能使被整合噬菌体的所有病毒序列缺失，因为在该情况下被感染细菌的生存力严重受损。具体而言，发明人证明，包含ral基因和N基因编码序列的DNA片段的缺失会导致宿主细胞死亡(见实施例)。该结果是令人意外的，因为并不知道ral和N基因参与到溶原状态中#基因仅仅被描述为是裂解生长所必需的。相反，在溶原状态中，噬菌体的阻抑物，被称为Cl或C2，阻断N和ral的表达。
[0036]因此，本发明涉及遗传修饰的噬菌体，其中
[0037]-表达系统被插入，和
[0038]-至少Int、Xis、R、S、Q和Rz基因中之一被灭活。
[0039]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且S基因被灭活。
[0040]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且R基因被灭活。
[0041]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且Q基因被灭活。
[0042]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且Int基因被灭活。
[0043]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且Xis基因被灭活。
[0044]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且S和Int基因被灭活。
[0045]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且S和Xis基因被灭活。
[0046]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且S和R基因被灭活。
[0047]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且S和Rz基因被灭活。
[0048]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且S和Q基因被灭活。
[0049]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且R和Rz基因被灭活。
[0050]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且R和Int基因被灭活。
[0051]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且R和Xis基因被灭活。
[0052]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且R和Q基因被灭活。
[0053]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且Q和Rz基因被灭活。
[0054]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且Q和Int基因被灭活。
[0055]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且Q和Xis基因被灭活。
[0056]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、Int和Xis基因被灭活。
[0057]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、Int和Rz基因被灭活。
[0058]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、Int和R基因被灭活。
[0059]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、Xis和Rz基因被灭活。
[0060]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、Xis和R基因被灭活。
[0061]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且S、R和Rz基因被灭活。
[0062]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且S、R和Q基因被灭活。
[0063]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且S、Q和Rz基因被灭活。
[0064]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且S、Q和Int基因被灭活。
[0065]在一个实施方案中，遗传修饰的嗷菌体包含表达系统并且S、Q和Xis基因被灭活。[0066]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且R、Int和Xis基因被灭活。
[0067]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且R、Int和Rz基因被灭活。
[0068]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且R、Xis和Rz基因被灭活。
[0069]在一个实施方案中，遗传修饰的卩遼菌体包含表达系统并且R、Q和Rz基因被灭活。
[0070]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且R、Xis和Q基因被灭活。[0071 ]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且R、Int和Q基因被灭活。
[0072]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且Q、Int和Rz基因被灭活。
[0073]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且Q、Int和Xis基因被灭
活。
[0074]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且Q、Xis和Rz基因被灭活。
[0075]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、Int、Xis和Rz基因被灭活。
[0076]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、Int、Xis和R基因被灭活。
[0077]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、Int、R和Rz基因被灭活。
[0078]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、R、Xis和Rz基因被灭活。
[0079]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且R、Rz、Xis和Int基因被灭活。
[0080]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且Q、R、Rz和S基因被灭活。
[0081]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且Q、R、Rz和Int基因被灭活。
[0082]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且Q、R、S和Int基因被灭活。
[0083]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且Q、Rz、S和Int基因被灭活。
[0084]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且Q、R、Rz和Xis基因被灭活。
[0085]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且Q、R、S和Xis基因被灭活。
[0086]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且Q、Rz、S和Xis基因被灭活。[0087]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且Q、R、Int和Xis基因被灭活。
[0088]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且Q、Rz、Int和Xis基因被灭活。
[0089]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且Q、S、Int和Xis基因被灭活。
[0090]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、R、Rz, Xis和Int基因被灭活。
[0091]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、R、Q、Rz和Xis基因被灭活。 [0092]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、R、Q、Rz和Int基因被灭活。
[0093]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、R、Q、Xis和Int基因被灭活。
[0094]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、Q、Rz, Xis和Int基因被灭活。
[0095]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且R、Q、Rz、Xis和Int基因被灭活。
[0096]在一个实施方案中，遗传修饰的噬菌体包含表达系统并且S、R、Q、Rz、Xis和Int基因被灭活。
[0097]可以用于本发明的曬菌体实例包括，但不限于，λ曬菌体、λ样(lambda-1 ike)和λ形(Iambdoid)噬菌体。λ噬菌体也称作大肠杆菌噬菌体λ，它是感染大肠杆菌的病毒。λ是温和噬菌体。λ样噬菌体组成一个特征为具有非收缩性长尾的噬菌体和古细菌病毒家族。λ形噬菌体是λ噬菌体的天然亲缘物。它们当中大多数在大肠杆菌上生长，但是极少数来源于其它的宿主细胞，诸如，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。这些曬菌体具有与λ相同的基因顺序。
[0098]可以在本发明中使用的λ样和λ形噬菌体的实例包括，但不限于，大肠杆菌噬菌体 434、phi80、phi81、HK97、P21 和 P22。
[0099]在一个实施方案中，噬菌体是λ (肠杆菌噬菌体λ，登录号NC_001416)。λ噬菌体的基因组组织示于下表1中。
[0100]
【权利要求】
1.遗传修饰的噬菌体，其中 -表达系统被插入， -S、R和/或Q基因被灭活，和 -1nt和/或Xis基因被灭活。
2.根据权利要求1的遗传修饰的噬菌体，其中Rz基因被灭活。
3.根据权利要求1至2任意一项的遗传修饰的噬菌体，其中 -表达系统被插入， -1nt基因、Xis基因以及R、S和Rz基因被灭活。
4.根据权利要求1至2任意一项的遗传修饰的噬菌体，其中 -表达系统被插入， -1nt基因、Xis基因以及Q、R、S和Rz基因被灭活。
5.根据权利要求1至4任意一项的遗传修饰的曬菌体,其中所述表达系统是T7表达系统。
6.根据权利要求1至5任意一项的遗传修饰的曬菌体,其中所述曬菌体是λ曬菌体、434噬菌体、phi80噬菌体、phi81噬菌体、HK97噬菌体、P21噬菌体。
7.根据权利要求1至6任意一项的遗传修饰的噬菌体，其中所述噬菌体是噬菌体Pll至P53中之一。
8.包含根据权利要求1至7任意一项的遗传修饰的噬菌体和辅助噬菌体的试剂盒。
9.包含根据权利要求1至7任意一项的遗传修饰的噬菌体的宿主细胞。
10.根据权利要求9的宿主细胞,其中所述宿主细胞是肠杆菌(enterobacteria),优选大肠杆菌(E.Co I i )，更优选BL21。
11.根据权利要求9至10任意一项的宿主细胞,还包含基因tonA、galK、araB、araA、1n、ompT、rcsA、hsdR、mrr、endA 和 recA 中至少一个基因的灭活。
12.根据权利要求9至11任意一项的宿主细胞，包含ccdb基因的插入。
13.包含根据权利要求12的宿主细胞和含ccdA基因的质粒的试剂盒。
14.用于制备根据权利要求9至12中任意一项的宿主细胞的方法，包括以根据权利要求I至7中任意一项的遗传修饰的噬菌体感染宿主细胞。
15.用于生产目的生物分子的方法，包括 -培养包含根据权利要求1至7中任意一项的遗传修饰的噬菌体和目的生物分子的核酸序列的宿主细胞， -收集所述目的生物分子。
【文档编号】C12N7/00GK103797113SQ201280042917
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年7月6日 优先权日:2011年7月7日
【发明者】C·斯派尔 申请人:德尔菲遗传学公司