人工接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农业微生物领域，具体涉及一种人工接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的方法。
【背景技术】
[0002]小麦光腥黑粉菌，又名小麦光腥黑穗病菌(拉丁名:Tilletia foetida)，为黑粉菌目、腥黑粉菌科、小麦光腥黑穗病菌属。它可引起小麦腥黑穗病。小麦光腥黑穗病菌冬孢子萌发时只生出一根原菌丝，而内壁发生多处消解。原菌丝含有多个细菌核，并有脂肪粒，核糖体，糖原和线粒体等。原菌丝顶端可形成8个担孢子，并桥接形成“H”型菌丝。其孢子生于子房内，外包果皮，与种子同大。其孢子呈球形至椭圆形，有时候为长圆形至多角形，淡灰褐色至榄褐色，平滑，有腥臭。
[0003]在对小麦光腥黑粉菌的生理生长情况和侵染机制的研究中，通常需要通过人工方法将它接种至小麦植株使后者感染得到染病小麦植株以进行观察和分析，但迄今为止，尚未存在一种人工接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的有效方法，以获得发病率较高的小麦植株用于研究。
【发明内容】
[0004]本发明基于上述领域的空白，提供了一种可获得较高发病率小麦植株的、有效的人工接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的方法。
[0005]本发明的技术方案如下:
[0006]人工接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0007](1)制备用于侵染的用小麦光腥黑粉菌菌丝悬液:
[0008]将小麦光腥黑粉菌的菌癭压碎，制备孢子悬液，将其涂布于2%的水琼脂培养基上，16°C培养箱中培养至冬孢子萌发并长出菌丝，用灭菌蒸馏水将菌丝冲洗下来，备用；
[0009](2)预备接种小麦苗:小麦种子浸泡至发芽，然后置于5°C春化处理一个月，将春化好的种子种于灭菌土中，待小麦苗长到拔节孕穗期时，备用；
[0010](3)接种:将步骤(1)获得的小麦光腥黑粉菌菌丝悬液注射入小麦植株的花药腔室的空隙内。
[0011]所述将步骤(1)获得的小麦光腥黑粉菌菌丝悬液注射入花药腔室的空隙内，连续注入2次，每天1次，24小时后再注射1次。
[0012]所述孢子悬液的浓度为105孢子/ml，将其涂布于2%的水琼脂培养基上，所述菌丝为冬孢子萌发后1天内的菌丝，每块直径9cm的水琼脂培养基平板上的菌丝采用2ml灭菌蒸馏水冲洗获得所述小麦光腥黑粉菌菌丝悬液。
[0013]每株小麦选取1个花药腔室的空隙进行接种。
[0014]所述接种的环境参数如下:温度20°C，光照时间24小时。
[0015]所述方法在研究小麦光腥黑粉菌方面的应用。
[0016]本发明提供了一种人工接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的方法，包括制备侵染用小麦光腥黑粉菌菌丝悬液和将所述菌丝悬液注入小麦花药腔室的空隙内。采用小麦光腥黑粉菌菌丝做为侵染源，而不是直接用冬孢子，侵染成功率更高，不再受限于孢子的萌发率。将菌丝制成悬液是为了使其更适于注入的方式。而选取孕穗期的小麦植株作为侵染受体，符合菌丝侵染的时期。本发明的方法大幅度提高了侵染成功率。
[0017]具体地，所述制备包括:培养小麦光腥黑粉菌至长出菌丝，用无菌蒸馏水冲洗所述菌丝制得所述侵染用小麦光腥黑粉菌菌丝悬液。该制备为菌丝悬液的具体制备步骤，采用该制备步骤可以获得有侵染活性的小麦光腥黑粉菌菌丝悬液。
[0018]进一步地，所述培养指，将小麦光腥黑粉菌的冬孢子制成悬液涂布于水琼脂培养基上，于16°C培养箱中培养。经过上述培养的小麦光腥黑粉菌冬孢子可成功地萌发并生长出符合侵染条件的菌丝。
[0019]进一步地，所述菌丝悬液注入小麦孕穗的次数为连续2次，每天1次，这样做的目的是为了保证侵染率和被侵染小麦植株的最终的发病率。
[0020]本发明还请求保护所述人工接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的方法在研究小麦光腥黑粉菌方面的应用。
[0021]经统计验证，采用本发明所提供的方法人工接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦，获得的被侵染小麦植株的小麦光腥黑穗病发病率高达90%。
[0022]同时，对接种的小麦材料进行连续观察，可以看到植株侵染过程。如图1E-G所示。对被侵染的小麦植株的变黑籽粒进行电镜观察，被确认为小麦光腥黑粉菌(Tilletiafoetide)的冬孢子，如图1H、I所示。
[0023]这表明，采用本发明所述的方法，可以获得发病小麦植株的成功率更大。并且，本发明的方法简单易行、便于实施操作、有利于推广应用。
【附图说明】
[0024]图1为本发明所述接种方法中的小麦光腥黑粉菌(Tilletia foetide)的侵染全过程。
[0025]图中标记示例如下:A:小麦光腥黑粉菌(Tilletia foetide)冬孢子；B:冬孢子萌发长出先菌丝；C:萌发长出初生担孢子；D:初生担孢子Η型融合产生次生担孢子；Ε:将萌发至长出的侵染菌丝注射到孕穗期的健康小麦苗；F:还未发病的麦穗；G:籽粒变黑:籽粒变成菌癭，内部充满黑粉；1:电镜下确认为小麦光腥黑粉菌(Tilletia foetide)的冬孢子。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例进一步详细说明本发明所述的制品，但并不以此限制本发明的范围。如无特殊说明，下述所采用的试剂与材料均可商购获得，所采用的方法均为常规操作。
[0027]牛物材料
[0028]小麦品种:冬选3号，为已知品种，可商购获得。
[0029]供试菌株:小麦光腥黑粉菌菌株，采样自河南田间。
[0030]试剂与耗材
[0031]琼脂、蒸馏水均商购获得。
[0032]培养基:2%的水琼脂培养基(具体成分:20g琼脂粉，1L蒸馏水)
[0033]实施例1、采用本发明所述方法人工接种小麦光腥黑粉菌
[0034]具体步骤:
[0035](1)制备用于侵染的用小麦光腥黑粉菌菌丝悬液:
[0036]将小麦光腥黑粉菌的菌癭压碎，制备孢子悬液，将其涂布于2%的水琼脂培养基上，16°C培养箱中培养至冬孢子萌发并长出菌丝，用灭菌蒸馏水将菌丝冲洗下来，备用；显微镜检查孢子萌发情况如图1A-D
[0037](2)预备接种小麦苗:小麦种子浸泡至发芽，然后置于5°C春化处理一个月，将春化好的种子种于灭菌土中，待小麦苗长到拔节孕穗期时，随机选取若干株健壮小麦植株备用；
[0038](3)接种:将步骤(1)获得的小麦光腥黑粉菌菌丝悬液注射入选取的小麦植株花药腔室的空隙内。
[0039]所述将步骤(1)获得的小麦光腥黑粉菌菌丝悬液注射入花药腔室的空隙内，连续注入次数为2次，每次1天。
[0040]所述孢子悬液的浓度为105孢子/ml，所述菌丝为冬孢子萌发后1-3天的菌丝，每块直径9cm的水琼脂培养基平板上的菌丝采用2ml灭菌蒸馏水冲洗获得所述小麦光腥黑粉菌菌丝悬液。
[0041]每株小麦选取1个花药腔室的空隙进行接种。
[0042]接种的环境参数如下:温度20°C，光照时间24小时。
[0043]接种后的至发病的小麦植株如图1F, G所不。发病植株菌癭及电镜观察如图1H, I所示。说明采用本发明的人工侵染方法能够成功获得染病植株。
[0044]调查本发明选取进行接种的小麦植株，本发明的方法获得发病植株为90%。
【主权项】
1.人工接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)制备用于侵染的用小麦光腥黑粉菌菌丝悬液: 将小麦光腥黑粉菌的菌癭压碎，制备孢子悬液，将其涂布于2%的水琼脂培养基上，16°C培养箱中培养至冬孢子萌发并长出菌丝，用灭菌蒸馏水将菌丝冲洗下来，备用； (2)预备接种小麦苗:小麦种子浸泡至发芽，然后置于5°C春化处理一个月，将春化好的种子种于灭菌土中，待小麦苗长到拔节孕穗期时，备用； (3)接种:将步骤(1)获得的小麦光腥黑粉菌菌丝悬液注射入小麦植株的花药腔室的空隙内。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将步骤(1)获得的小麦光腥黑粉菌菌丝悬液注射入花药腔室的空隙内，连续注入2次，每天1次，24小时后再注射1次。3.根据权利要求1或2所述的方法，所述孢子悬液的浓度为105孢子/ml，将其涂布于2%的水琼脂培养基上，所述菌丝为冬孢子萌发后1天内的菌丝，每块直径9cm的水琼脂培养基平板上的菌丝采用2ml灭菌蒸馏水冲洗获得所述小麦光腥黑粉菌菌丝悬液。4.根据权利要求1-3任一所述的方法，每株小麦选取1个花药腔室的空隙进行接种。5.根据权利要求1或2所述的方法，所述接种的环境参数如下:温度20°C，光照时间24小时。6.权利要求1-3任一所述的方法在研究小麦光腥黑粉菌方面的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种人工接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的方法，属于农业微生物领域。所述方法包括：(1)制备用于侵染的用小麦光腥黑粉菌菌丝悬液：将小麦光腥黑粉菌的菌瘿压碎，制备孢子悬液，将其涂布于2％的水琼脂培养基上，16℃培养箱中培养至冬孢子萌发并长出菌丝，用灭菌蒸馏水将菌丝冲洗下来，备用；(2)预备接种小麦苗：小麦种子浸泡至发芽，然后置于5℃春化处理一个月，将春化好的种子种于灭菌土中，待小麦苗长到拔节孕穗期时，备用；(3)接种：将步骤(1)获得的小麦光腥黑粉菌菌丝悬液注射入小麦植株的花药腔室的空隙内。采用本发明的方法获得发病小麦植株的成功率更大。并且，本发明的方法简单易行、便于实施操作、有利于推广应用。
【IPC分类】A01G7/06, C12Q1/04
【公开号】CN105409618
【申请号】CN201510796670
【发明人】高利, 沈慧敏, 蔚慧欣, 陈万权, 刘太国, 刘博
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年11月18日