用于鉴别小麦矮腥黑穗病菌和小麦光腥黑穗病菌的冬孢子的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞生物技术领域，具体涉及一种利用激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)鉴别小麦矮腥黑穗病菌和小麦光腥黑穗病菌的冬孢子的方法。
【背景技术】
[0002]小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kuhn, TCK)是引起的小麦矮腥黑粉病(Wheat dwarf bunt disease, DB)的一种系统侵染性病害，是麦类黑粉病中危害最大、极难防治的国内外重要检疫性病害之一。该病菌与其近似种小麦网腥黑穗病菌(T.cariesTul.，TCT)、小麦光腥黑穗病菌(T.foeyida.，TFL)在形态学上极为相似，不易区分，这给进境美国小麦的TCK检疫带来相当困难。在20世纪80年代末90年代初，经中美两国有关专家多年努力和协商，最后根据1986年Stoekwell提出TCK冬孢子具有特异的自发荧光特性，解决了进境美国小麦中的TCK鉴定问题。
【发明内容】
[0003]本发明尝试应用激光共聚焦显微扫描术(CLSM)，探讨了 TCK和TFL冬孢子的自发荧光特性，以克服目前应用光学显微镜检测TCK存在的缺点，提高进口小麦TCK检疫水平。
[0004]本发明的技术方案如下:
[0005]1、用于鉴别小麦矮腥黑穗病菌和小麦光腥黑穗病菌的冬孢子的方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0006](I)制片:将小麦矮腥黑穗病菌和小麦光腥黑穗病菌的冬孢子分别涂片，干燥后，在镜检部位滴加油镜镜头油，再加盖玻片；
[0007](2)观察:将制好的玻片放置于激光共聚焦扫描显微镜下，选取合适的扫描模式和扫描参数进行扫描观察并拍照；
[0008]所述扫描模式为xyz扫描模式；
[0009]所述扫描参数包括激发光波长和发射光波长；
[0010]其中，小麦矮腥黑穗病菌的激发光波长为488nm，发射光波长为510?550nm ;
[0011]小麦光腥黑穗病菌的激发光波长为530nm，发射光波长为550?600nm ;或激发光波长为488nm，发射光波长为510?550nmo
[0012]2、根据权利要求1所述的方法，小麦光腥黑穗病菌的激发光波长为488nm，发射光波长为510?550nm。
[0013]本文应用共聚焦激光扫描显微术(CLSM)对小麦矮腥黑穗病(TCK)和小麦光腥黑穗病菌(TFL)冬孢子的自发荧光特性进行了研究。研究表明:在这两种冬孢子中，它们各自都含有自发荧光物质，而且TCK (激发光488nm/发射光510?550nm) ;TFL (激发光530nm/发射光550?600nm，激发光488nm/发射光510?550nm，但是激发光488nm/发射光510?550nm好一些)下焚光分布均勾，大体形态清楚；但层切扫描发现自发焚光在这两种冬孢子的空间分布存在明显差异:TCK冬孢子的自发焚光物质主要分布在外孢壁和网脊上，而在原生质中分布少；TFL冬孢子的自发荧光物质主要分布在孢壁，原生质中分布少。应用CLSM在实际TCK检测工作中，能克服荧光显微镜存在的检测重复性较差、可靠性小的缺点，提升了 TCK检验检疫的技术水平。
【附图说明】
[0014]图1是小麦中TCK和TFL冬孢子在Leica TCS SP5 CLSM系统488nm激发下的自发荧光连续层切扫描图片:A.TCK冬孢子；B.TFL冬孢子(Ibar = 5 μπι)。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例进一步详细说明本发明所述的制品，但并不以此限制本发明的范围。如无特殊说明，下述所采用的试剂与材料均可商购获得，所采用的方法均为常规操作。
_6] 生物材料的来源
[0017]小麦矮腥黑穗病菌、小麦光腥黑穗病菌菌癭收集自申请人实验室被侵染的小麦植株。
_8] 主要仪器设备
[0019]Leica TCS SP5 CLSM 系统
[0020]实施例1.利用本发明所述方法鉴别TCK和TFL冬孢子
[0021]I材料与方法
[0022]1.1供试材料
[0023]供试病原菌:小麦矮腥黑穗病菌、小麦光腥黑穗病菌菌癭各3株。
[0024]玻片制作:按国家标准GB/T 18085 一 2000给出的方法制作冬孢子涂片，干燥后，在镜检部位加I滴无荧光物质的油镜镜头油，加盖玻片，制成用于共聚焦激光扫描显微镜自发荧光检测的玻片。
[0025]CLSM系统:采用高性能的Leica TCS SP8，整个系统主要由I台倒置荧光相差显微镜、I组由半导体激光器、氩离子气体激光器、氦氖离子气体激光器组成多波长激光器、以及I台控制系统运行的工作站构成。
[0026]1.2自发荧光的逐层扫描(xyz扫描)观察方法
[0027]选取xyz扫描模式，选用激发波长488nm/530nm激发光和系统已设定好的相应程序，分别激发TCK和TFL冬孢子，进行光学切片，z轴层切扫描分析。
[0028]1.3图像分析
[0029]根据试验结果所获得的图像，观察自发荧光在TCK和TFL冬孢子各自的空间分布情况以及小麦中TCK和TFL冬孢子各自的自发荧光特性。
[0030]2 结果
[0031]2.1 TCK和TFL冬孢子的xyz扫描
[0032]以488nm/530nm波长激发光分别对TCK和TFL冬孢子进行光学切片，z轴层切扫描，各自获得30张不同层面的连续光学切片扫描图像。
[0033]2.2 TCK和TFL冬孢子各自的自发荧光特性
[0034]经过对小麦中TCK和TCT冬孢子的xy λ和xyz扫描显示，在两种冬孢子中，它们各自都含有自发焚光物质，而且都能在488nm波长激发光激发下，在510?550nm范围中得到相应发射光，荧光光分布均匀，大体形态清楚，同时在明场下可观察到其不同层面的清晰结构。但层切扫描发现自发焚光在这两种冬孢子的空间分布存在明显差异:TCK冬孢子的自发荧光物质主要分布在外孢壁和网脊上，而在原生质中分布少；TFL冬孢子的自发荧光物质主要分布在孢壁，原生质中分布少。
[0035]3 讨论
[0036]本文首次应用CLSM技术手段，通过激光共聚焦xyz扫描，描述了 TCK和TFL这两种冬孢子各自的自发荧光特性，进一步揭示了为何在普通落射荧光显微镜(激发滤片485nm，屏障滤片520nm)下会观测到TCK冬孢子网纹呈黄色或黄绿色，或呈镶边现象(仅网纹边缘具焚光)。而在对TFL的研究中，一般使用普通光学显微镜区分，由小麦光腥黑粉菌和小麦网腥黑粉菌引起的普通腥黑穗病除少数受基因调控的孢子壁不同之外，这两种真菌非常相似。它们杂交可以产生一系列的形态变异个体，现已观察到介于光腥黑粉菌和网腥黑粉菌冬抱子形态之间所有过渡的自然变异个体，形态上的中间类型可能代表种间杂种，一般的形态学鉴定方法很难将它们区别开。采用CLSM技术，可准确、快速鉴别TFL。
[0037]在荧光显微分析技术的基础上发展起来的共聚焦激光扫描显微术是一种现代的先进技术，由于使用的是激光作为光源，通过点扫描和高灵敏接收，并进行数字成像，其原理和成像方式与前者有本质区别，后者特别适宜对弱自发荧光的观察。在TCK实际检测过程中和原先的荧光显微术相比较，使用高性能的共聚焦激光扫描显微镜，能够获得清晰的数字扫描图像，重复性好，结果的可靠性较好。因此随着共聚焦激光扫描显微镜在检验检疫系统不断地普及，在TCK检测工作中应用CLSM，是检验检疫科学技术水平质的飞跃。
【主权项】
1.用于鉴别小麦矮腥黑穗病菌和小麦光腥黑穗病菌的冬孢子的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)制片:将小麦矮腥黑穗病菌和小麦光腥黑穗病菌的冬孢子分别涂片，干燥后，在镜检部位滴加油镜镜头油，再加盖玻片； (2)观察:将制好的玻片放置于激光共聚焦扫描显微镜下，选取合适的扫描模式和扫描参数进行扫描观察并拍照； 所述扫描模式为xyz扫描模式； 所述扫描参数包括激发光波长和发射光波长； 其中，小麦矮腥黑穗病菌的激发光波长为488nm，发射光波长为510?550nm ; 小麦光腥黑穗病菌的激发光波长为530nm，发射光波长为550?600nm ;或激发光波长为488nm，发射光波长为510?550nm。2.根据权利要求1所述的方法，小麦光腥黑穗病菌的激发光波长为488nm，发射光波长为 510 ?550nm。
【专利摘要】本发明提供了一种用于鉴别小麦矮腥黑穗病菌和小麦光腥黑穗病菌的冬孢子的方法，涉及细胞生物技术领域。所述方法包括如下步骤：(1)制片：将小麦矮腥黑穗病菌和小麦光腥黑穗病菌的冬孢子分别涂片，干燥后，在镜检部位滴加油镜镜头油，再加盖玻片；(2)观察：将制好的玻片放置于激光共聚焦扫描显微镜下，选取合适的扫描模式和扫描参数进行扫描观察并拍照；所述扫描模式为xyz扫描模式；所述扫描参数包括激发光波长和发射光波长；其中，小麦矮腥黑穗病菌的激发光波长为488nm，发射光波长为510～550nm；小麦光腥黑穗病菌的激发光波长为530nm，发射光波长为550～600nm；或激发光波长为488nm，发射光波长为510～550nm。采用所述方法可以快速鉴别出小麦矮腥黑穗病菌和小麦光腥黑穗病菌的冬孢子。
【IPC分类】C12R1/645, C12Q1/04
【公开号】CN105039491
【申请号】CN201510404497
【发明人】高利, 蔚慧欣, 陈万权, 刘太国, 刘博
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月10日