专利名称：禾长蠕孢菌孢子的培养方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及禾长蠕孢菌孢子的培养方法。
背景技术：
稗草是稻田恶性杂草，若不防除将严重影响水稻产量，目前主要通过化学除草剂 防除。化学除草剂虽然可以快速防除稻田稗草，但是，长期大量使用也带来很多负面影响， 如稗草抗药性生物型增加，局部地区农田和水环境被污染，对环境和生态安全以及农业可 持续发展构成潜在威胁等。微生物除草剂是利用生物活体或生物活性物质开发的生物制 剂，具有对环境无污染、无残留且不易使作物产生抗药性等优点，因而是化学除草剂很好补 充和替代品，受到各国科学家的普遍重视。禾长蠕孢菌是从自然感病稗草上分离得到杂草 生防潜力菌，对水稻、小麦、玉米、棉花和油菜等作物安全。禾长蠕孢菌孢子悬浮剂对稗草最 高防效可达到85. 2 %，对鸭舌草、野荸荠、陌上菜等其它杂草的防效也在80 %以上。因此 禾长螺孢菌有潜力开发成防除稗草的真菌除草剂，其孢子可作为真菌除草剂的主要活性成 分。目前，禾长蠕孢菌大面积推广应用的关键在于其孢子批量生产技术。因此，研制开 发成本低廉的培养基配方及简便易行的生产工艺是禾长蠕孢菌开发真菌除草剂的重要课 题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种禾长蠕孢菌孢子的培 养方法的技术方案，该方法简单易行，成本低廉，且能大批量的得到禾长蠕孢菌孢子。所述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，其特征在于包括以下工艺步骤1)接种体的制备将4°C斜面保存的出发菌株禾长蠕孢菌转接到新鲜PDA培养基上，在27 29°C黑 暗条件下活化培养6 8天后，取直径为4. 5 6. 5mm的菌块，接种于PDB培养基中，在温 度27 29°C，转速100 250r/min条件下振荡培养2 4天，然后取8 12mL处于对数 生长期的菌悬液接种于IOOmL新鲜PDB中，在温度27 29°C，转速100 250r/min条件下 振荡培养2 4天后，备用；2)禾长蠕孢菌孢子生产培养基的制备以珍珠岩、稻壳或麦秸秆为底物基质，然后以底物基质体积为基准，加入占底物基 质体积3% 8% (w ν)的燕麦粉、米粉或小麦粉，0.5% 1.5% (w ν)的豆粕粉、大豆 蛋白粉或大豆粉，0. 1 0.2% (w v) &MgS04，0.1 0.2% (w ν)的 Na3PO4 和 30% 50% (w ν)的水分，混合均勻后121°C高压灭菌20min，冷却后备用；3)禾长蠕孢菌孢子的培养取步骤2)得到的禾长蠕孢菌孢子生产培养基，再在培养基中接种占培养基重量 6% 8%的步骤1)得到的禾长蠕孢菌菌丝体悬液接种体，然后在25 28°C、黑光灯或紫外灯12小时循环光照条件下培养7 14天，得到孢子物。所述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，其特征在于所述的步骤1)中出发菌株禾长 蠕孢菌转接到新鲜PDA培养基后，在28°C黑暗条件下活化培养7天。所述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，其特征在于所述的步骤1)中取直径为5. 5mm 的菌块，接种于PDB培养基中，在温度28°C，转速150r/min条件下振荡培养3天。所述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，其特征在于所述的步骤1)中取10mL处于对 数生长期的菌悬液接种于lOOmL新鲜PDB中，在温度28°C，转速150r/min条件下振荡培养 3天。所述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，其特征在于所述的步骤2)中以底物基质体 积为基准，加入占底物基质体积4% 7%的燕麦粉、米粉或小麦粉， 1. 5%的豆粕粉、 大豆蛋白粉或大豆粉，0. 15 0. 2%的MgS04，0. 15 0. 2%的Na3P04和35% 45%的水 分。所述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，其特征在于所述的步骤2)中麦秸秆为加工 至粉末状的麦秸秆。所述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，其特征在于所述的步骤2)中在培养基中接 种7%的禾长蠕孢菌菌丝体悬液接种体，然后在26 27°C、黑光灯或紫外灯12小时循环光 照条件下培养9 12天。上述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，设计合理，发明中涉及的生产培养基组成简 单，成本低廉，涉及的孢子培养和生产方法简单易行，其孢子产量可以达到0.213士0.0145 亿孢子/g底物基质，使得禾长蠕孢菌孢子制剂的开发成为可能。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步说明本发明。实施例11)接种体的制备将4°C斜面保存的出发菌株禾长蠕孢菌转接到新鲜PDA培养基上，在27°C黑暗 条件下活化培养8天后，取直径为6. 5mm的菌块，接种于PDB培养基中，在温度27 V，转速 100r/min条件下振荡培养2天，然后取8mL处于对数生长期的菌悬液接种于lOOmL新鲜PDB 中，在温度27°C，转速lOOr/min条件下振荡培养2天后，备用；2)禾长蠕孢菌孢子生产培养基的制备以珍珠岩为底物基质，添加珍珠岩体积4%的小麦粉、珍珠岩体积0. 5%的豆粕 粉、珍珠岩体积0. 1 %的MgS04、珍珠岩体积0. 2%的Na3P04和珍珠岩体积50%自来水；混合 均勻后培养基在121°C高温灭菌20min ；3)禾长蠕孢菌孢子的培养取步骤2)得到的禾长蠕孢菌孢子生产培养基，再在培养基中接种占培养基重量 6%的步骤1)得到的禾长蠕孢菌菌丝体悬液接种体，然后在25°C、黑光灯循环光照条件下 培养7天，得到孢子液，孢子液中孢子产量约为0. 187士0. 0152亿孢子/克底物基质。涉及的PDA培养基含有马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L。涉及的PDB培养基含有马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L。
实施例21)接种体的制备将4°C斜面保存的出发菌株禾长蠕孢菌转接到新鲜PDA培养基上，在28°C黑暗 条件下活化培养7天后，取直径为5. 5mm的菌块，接种于PDB培养基中，在温度28°C，转速 150r/min条件下振荡培养3天，然后取IOmL处于对数生长期的菌悬液接种于IOOmL新鲜 PDB中，在温度28°C，转速150r/min条件下振荡培养3天后，备用；2)禾长蠕孢菌孢子生产培养基的制备以珍珠岩为底物基质，添加珍珠岩体积4%的米粉、珍珠岩体积1 %的豆粕粉、珍 珠岩体积0. 的MgSO4、珍珠岩体积0. 2%的Na3PO4和珍珠岩体积40%自来水；混合均勻 后培养基在121°C高温灭菌20min ；3)禾长蠕孢菌孢子的培养取步骤2)得到的禾长蠕孢菌孢子生产培养基，再在培养基中接种占培养基重量 8%的步骤1)得到的禾长蠕孢菌菌丝体悬液接种体，然后在26°C、黑光灯循环光照条件下 培养11天，得到孢子培养物，孢子培养物中孢子产量约为0. 213士0. 0145亿孢子/克底物基质。实施例31)接种体的制备将4°C斜面保存的出发菌株禾长蠕孢菌转接到新鲜PDA培养基上，在28°C黑暗 条件下活化培养7天后，取直径为5. 5mm的菌块，接种于PDB培养基中，在温度28°C，转速 150r/min条件下振荡培养3天，然后取IOmL处于对数生长期的菌悬液接种于IOOmL新鲜 PDB中，在温度28°C，转速150r/min条件下振荡培养3天后，备用；2)禾长蠕孢菌孢子生产培养基的制备以粉末状麦秸秆为底物基质，添加麦秸秆体积6%的燕麦粉、麦秸秆体积0. 5%的 大豆蛋白粉、麦秸秆体积0. 2%的MgSO4、麦秸秆体积0. 的Na3PO4和麦秸秆体积30%自 来水；混合均勻后培养基在121°C高温灭菌20min ；3)禾长蠕孢菌孢子的培养取步骤2)得到的禾长蠕孢菌孢子生产培养基，再在培养基中接种占培养基重量 8%的步骤1)得到的禾长蠕孢菌菌丝体悬液接种体，然后在27°C、紫外灯循环光照条件下 培养12天，得到孢子培养物，孢子培养物中孢子产量约为0. 194士0. 0122亿孢子/克底物基质。实施例41)接种体的制备将4°C斜面保存的出发菌株禾长蠕孢菌转接到新鲜PDA培养基上，在29°C黑暗 条件下活化培养6天后，取直径为4. 5mm的菌块，接种于PDB培养基中，在温度29°C，转速 250r/min条件下振荡培养4天，然后取12mL处于对数生长期的菌悬液接种于IOOmL新鲜 PDB中，在温度29°C，转速250r/min条件下振荡培养4天后，备用；2)禾长蠕孢菌孢子生产培养基的制备以稻壳为底物基质，添加稻壳体积3%的米粉、稻壳体积1. 5%的大豆粉、稻壳体 积0. 2%的MgSO4、稻壳体积0. 的Na3PO4和稻壳体积40%自来水；混合均勻后培养基在
5121 °C高温灭菌20min ；3)禾长蠕孢菌孢子的培养取步骤2)得到的禾长蠕孢菌孢子生产培养基，再在培养基中接种占培养基重量 8%的步骤1)得到的禾长蠕孢菌菌丝体悬液接种体，然后在28°C、紫外灯循环光照条件下 培养14天，得到孢子培养物，孢子培养物中孢子产量约为0. 179士0. 0129亿孢子/克底物基质。
权利要求
禾长蠕孢菌孢子的培养方法，其特征在于包括以下工艺步骤1)接种体的制备将4℃斜面保存的出发菌株禾长蠕孢菌转接到新鲜PDA培养基上，在27～29℃黑暗条件下活化培养6～8天后，取直径为4.5～6.5mm的菌块，接种于PDB培养基中，在温度27～29℃，转速100～250r/min条件下振荡培养2～4天，然后取8～12mL处于对数生长期的菌悬液接种于100mL新鲜PDB中，在温度27～29℃，转速100～250r/min条件下振荡培养2～4天后，备用；2)禾长蠕孢菌孢子生产培养基的制备以珍珠岩、稻壳或麦秸秆为底物基质，然后以底物基质体积为基准，加入占底物基质体积3％～8％的燕麦粉、米粉或小麦粉，0.5％～1.5％的豆粕粉、大豆蛋白粉或大豆粉，0.1～0.2％的MgSO4，0.1～0.2％的Na3PO4和30％～50％的水分，混合均匀后121℃高压灭菌20min，冷却后备用；3)禾长蠕孢菌孢子的培养取步骤2)得到的禾长蠕孢菌孢子生产培养基，再在培养基中接种占培养基重量6％～8％的步骤1)得到的禾长蠕孢菌菌丝体悬液接种体，然后在25～28℃、黑光灯或紫外灯12小时循环光照条件下培养7～14天，得到孢子物。
2.如权利要求1所述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，其特征在于所述的步骤1)中出发 菌株禾长蠕孢菌转接到新鲜PDA培养基后，在28°C黑暗条件下活化培养7天。
3 如权利要求1所述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，其特征在于所述的步骤1)中取 直径为5. 5mm的菌块，接种于PDB培养基中，在温度28°C，转速150r/min条件下振荡培养3 天。
4.如权利要求1所述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，其特征在于所述的步骤1)中取 IOmL处于对数生长期的菌悬液接种于IOOmL新鲜PDB中，在温度28°C，转速150r/min条件 下振荡培养3天。
5.如权利要求1所述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，其特征在于所述的步骤2)中以底 物基质体积为基准，加入占底物基质体积4% 7%的燕麦粉、米粉或小麦粉， 1.5% 的豆粕粉、大豆蛋白粉或大豆粉，0. 15 0. 2%的MgSO4,0. 15 0. 2%的Na3PO4和35% 45%的水分。
6.如权利要求1所述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，其特征在于所述的步骤2)中麦秸 秆为加工至粉末状的麦秸秆。
7.如权利要求1所述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，其特征在于所述的步骤2)中在 培养基中接种7%的禾长蠕孢菌菌丝体悬液接种体，然后在26 27°C、黑光灯或紫外灯12 小时循环光照条件下培养9 12天。
全文摘要
禾长蠕孢菌孢子的培养方法，属于微生物技术领域。其包括以下步骤1)接种体的制备；2)禾长蠕孢菌孢子生产培养基的制备；3)禾长蠕孢菌孢子的培养。上述的禾长蠕孢菌孢子的培养方法，设计合理，发明中涉及的生产培养基组成简单，成本低廉，涉及的孢子培养和生产方法简单易行，其孢子产量可以达到0.213±0.0145亿孢子/g底物基质，使得禾长蠕孢菌孢子制剂的开发成为可能。
文档编号C12N3/00GK101886058SQ20101020959
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月24日 优先权日2010年6月24日
发明者余柳青, 张建萍, 杨爽, 段桂芳 申请人:中国水稻研究所