专利名称：：一株拟盘多毛孢属内生真菌及所产生的抗肿瘤活性化合物的发现及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一株拟盘多毛孢属内生真菌无花果拟盘多毛孢(尸^to/o"o/w^,/)N56及所产生的抗宫颈癌(HeLa)及结肠癌(HT29)活性化合物的发现及应用，属医药
技术领域：
。
背景技术：
：恶性肿瘤是目前严重危害人类生命和生活质量的主要疾病之一，发病率逐年上升。在第18届国际抗癌联盟大会上，世界卫生组织的一项研究报告表明，今后20年新发肿瘤患者人数将由目前每年1000万增加到1500万，每年因恶性肿瘤而死亡的人数也将由600万增至1000万。据国家卫生部统计，20世纪卯年代我国肿瘤发病率已上升为127/10万。近年来我国每年新增肿瘤患者160万170万，总数估计在450万左右。在恶性肿瘤的三大疗法中，药物治疗占有重要的地位。在合成化学类抗肿瘤药物中绝大多数都是以天然抗肿瘤活性成分为先导化合物。据报道，19841995年，天然产物占上市抗肿瘤药的60%以上；1983年以前在美国上市以及19831994年全世界批准广泛使用的92种抗肿瘤药中，约62种来源于天然产物；19951999年，3个天然产物的衍生物作为新抗肿瘤药上市，由此可见，天然产物是结构新颖和作用独特的抗肿瘤化合物的重要来源。本发明涉及的化合物Chloropupukeananin和PestalofoneC是已报道过的化合物，但抗肿瘤活性是首次报道。本发明专利在真菌次生代谢产物活性化合物筛选基础上，发现了生产菌株无花果拟盘多毛孢CPy"')N56的固体发酵提取物具有抗宫颈癌及结肠癌活性；以活性跟踪为指导，分离纯化得到了两个活性化合物。通过对化合物进行抗肿瘤活性评价，发现其具有显著的抗肿瘤活性
发明内容本发明的目的是发现具有抗肿瘤活性的菌株、产生的抗肿瘤(宫颈癌/结肠癌)活性次生代谢产物及其应用价值研究。在一个方面中，本发明提供生产抗肿瘤化合物的菌株，其为无花果拟盘多毛孢(尸"to/o^;^,c/)菌株N56，该菌株分离自杭州地区的茶树枝上，并于2008年12月24日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)保藏(保藏号为CGMCCNo.2826)。在一个实施方案中，所述抗肿瘤化合物为Chloropupukeananin(l)和PestalofoneC(2)是从菌株PN56的固体发酵提取物分离得到的，其结构式为12本发明的活性化合物的物化常数、氢谱和碳谱数据分别见表1、2和3。表1.化合物Chloropupukeananin禾BPestalofoneC的物化常数名称分子式ESIMSIR(neat)v隨3443,2960,2929，1746，ChloropupukeananinC33H35C10ii6421730,1662，1643,1571,1449,1368,1262,1190,1092cm-13423(br),2971,2929,1709,PestalofoneCG32H40O65201674,1440,1378,1233,1028cm-15表2.化合物Chloropupukeananin的氢谱和碳谱数据(Acetone-^)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3.化合物PestalofoneC的氢谱和碳谱数据(Acetone《)position3H(mult.,JHH)11.61，s18.1，CH321,67，s25.9,CH33135.7,qC45,00,t(7,5)118.0,CH2.42，dd(16，7.5)27.5,CH25b2.82,dd(16，7.5)662.8，qC73.46,d(1.5)61.9，CH84.16，dddd(10,6.0,65.6,CH4.5，1,5)9a1.70，dd(14,10)35.2，CH29b1.98，dd(14，4.5)1052.8,qC11135.9,qC125.92，s135.1，CH13144.5,qC14a4.78,s115.6,CH214b4.93,s151.65,s22.2，CH316205.3,qCr1.63，s18.0，CH32,1.69,s25.9,CH33,135.5,qC4,5.06，t(7.5)118.6，CH5'a2.39，dd(15,7.5)28.4，CH25'b2.72，dd(15，7.5)6,63.6，qC7,3.49,d(1.5)62.8,CH8,4.12，dddd(12，6.3,67.5,CH5.5，1.5)9'a2.58,dd(15,12)34.2,CH29'b3.06，dd(15,5,5)10'127.5,qC11'148.6，qC12'7.12,s122.2，CH13'143.1，qC14'a1.84,d(18)44.8，CH214'b3.11,d(18)7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在一个实施方案中，所述肿瘤为宫颈癌或结肠癌。在一个方面中，本发明提供生产抗肿瘤化合物的方法，所述方法包括用上述无花果拟盘多毛孢(Py^)菌株N56进行发酵，并从发酵产物中得到所述抗肿瘤化合物。在一个实施方案中，所述抗肿瘤化合物为Chloropupukeananin或PestalofoneC。在一个实施方案中，所述肿瘤为宫颈癌或结肠癌。在一个实施方案中，所述发酵为固体发酵。在一个方面中，本发明提供所述Chloropupukeananin或PestalofoneC在制备抗肿瘤药物中的应用。在一个实施方案中，所述肿瘤为宫颈癌或结肠癌°在一个方面中，本发明提供一种抗肿瘤药物，其包含Chloropupukeananin或PestalofoneC作为活性成分。在一个实施方案中，所述肿瘤为宫颈癌或结肠癌。本发明涉及的化合物Chloropupukeananin对HeLa细胞和HT29细胞增殖抑制的ICso值分别为0,9、4.3〃g/mL，化合物PestalofoneC对HeLa细胞增殖抑制的IQ。值为1.2pg/mL。阳性对照物5-氟尿嘧啶的ICsQ为5、^g/mL。本发明对研究与开发新的抗肿瘤(宫颈癌和结肠癌)药物提供了候选化合物，为开发利用微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。图1是化合物Chloropupukeananin的氢谱(400MHz,氘代丙酮)图2是化合物Chloropupukeananin的碳谱(100MHz，氘代丙酮)图3是化合物PestalofoneC的氢谱(400MHz,氖代丙酮)图4是化合物PestalofoneC的碳谱(100MHz,氘代丙酮)具体实施例方式本发明将借助下面的实施例进行进一步的说明，但是本发明并不受限于下面的实施例。实施例l菌株N56的分离鉴定及其菌学特性1.分离方法釆用常规内生真菌分离方法，具体步骤如下将健康的植物枝条和叶片用水洗净、晾干，用75%的酒精浸泡消毒60秒，25%(1.3%有效氯)的次氯酸钠浸泡消毒5分钟，再用75%的酒精浸泡消毒30秒，后用无菌水洗3次，将消毒后的组织块剪切成边长约5mm的小块，放置于PDA培养基上，置25。C培养。用稀释法作单孢纯化，对不易产孢菌株用灭过菌的康乃馨(Z)fa^/n^cc^vo/7/^//^)叶片组织诱发产孢。参照Steyeart(1949)，Sutton(1980)和NagRaj(1993)[SteyeartR.L,Bull.Jard.Bot.6tatBruxelles,1949,19:285-354;SuttonB.C.TheCoelomycetes.Kew，Surrey,England:CommonwealthMycologicalInstitute,1980,263-266;NagRagT.R.Coelomycetousanamorphswithappendage-bearingconidia.Canada:MycologuePublication.Waterloo,Ontario,Canada.1993,llOl.]拟盘多毛孢属的分类系统，结合Guba(1961)[GubaE.F.MonographofMo"oc/zaetoand尸e加/oft'a.HarvardUniversityPress,Massachusetts.1961，342]盘多毛孢属(Pestalotia)5细胞组的检索表以及查阅多年来发表的新种资料，对分离到的内生拟盘多毛孢菌株进行鉴定。2.形态学特征如下在PDA培养基+康乃馨叶片上，分生孢子盘黑色，半球形或球形，埋藏于表皮下，后突破表皮。分生孢子5细胞，长梭形，有的稍弯曲，21-2S.6x5-7.2pm;中间3色孢长14-18pm，上2色胞褐色，第3色孢颜色略浅，淡褐色；顶端无色孢圆柱形，具顶端附属丝2-4根，3根为主，顶端附属丝长13-28.6pm，末端呈匙状膨大；基部无色胞三角形，据中生式柄1根，长2.6-6.5)im，末端呈球状膨大。PDA培养基上菌落白色，背面有黑色素沉积。分生孢子堆排列密集。实施例2化合物Chloropupukeananin和PestalofoneC的分离制备a.无花果拟盘多毛孢(/5,c/)菌株N56的活化PDA培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25。C培养7天；b.无花果拟盘多毛孢CRy^)N56的固体发酵大米培养基的制备(将100g大米和100mL水加入500mL三角瓶中，浸泡过夜，灭菌冷却待用)；将制备好的无花果拟盘多毛孢菌N56菌株悬液(孢子浓度为1x106个/mL)5mL接种于大米培养基上，25°C培养40天；c.待发酵完毕，将200mL乙酸乙酯加入三角瓶中室温提取三次，减压蒸干有机溶剂，得到粗提物2.8g;d.将粗提物用石油醚-乙酸乙酯体系(石油醚:乙酸乙酯=9:1;4:1;7:3;3:2;1:1;2:3;3:7;1:4;1:9)进行减压硅胶柱层析(8x30cm,薄层层析硅胶)；e.以活性跟踪指导，将活性组分(石油醚:乙酸乙酯=4:1;7:3)通过SephadexLH-20分离(氯仿甲醇=1:1)，进一步通过反相HPLC(KramosilC'8柱；10(im;10x250mm;2mL/min;70%甲醇/水20min后增加到85%;70%甲醇/水20min后增加到80%)制备得到活性化合物Chloropupukeananin禾口PestalofoneC。通过应用质谱、核磁共振波谱及红外光谱等技术[参见Liu,L.;Liu,S.;Jiang,L.;Chen,X.;Guo,L.;Che,Y.Og.Ze//.2008,/0，1397—1400.和Liu，L.;Liu,S.;Chen,X.;Guo,L,;Che,Y.MedC/zem.2009,/7,606-613.]确定化合物为Chloropupukeananin和PestalofoneC(氢谱和碳谱见附图1-4)实施例3采用MTT(噻唑蓝，Koparal,A.T.;Tuylu,B.A.;Turk，H.Ato.户rad2006，20，1300-1307.)法检测Chloropupukeananin和PestalofoneC对于肿瘤细胞的抑制活性1.试验用试剂将本发明制备的Chloropupukeananin和PestalofoneC用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂分别配制0.4，2，10，40mg/mL的待测溶液；阳性对照物为5-氟尿嘧啶。本实验所用肿瘤细胞株为HeLa细胞株和HT29细胞株(ATCC)。2.试验方法(1)将HeLa和HT29肿瘤细胞培养于coming96孔板(华粤行仪器有限公司)中，每孔细胞数为104个，DMEM培养基(含4500mg/ID-葡萄糖和L-谷氨酰胺，Invitrogen公司生产)100微升。(2)在37。C，5。/。C02条件下培养16-18小时，用PBS洗涤，加入适当浓度的化合物Chloropupukeananin和PestalofoneC溶液，孵育4小日寸。(3)培养结束后，用新鲜DMEM培养基替换化合物溶液，在37。C，5%C02条件再培养48小时。(4)培养结束后，每个孔中加入50微升(浓度为0.5毫克/毫升)的MTT(噻唑蓝)溶液，在37。C条件下培养3小时。(5)除去培养基和MTT溶液，在每孔中加入200微升DMSO(二甲基亚砜)溶液。(6)使用microplateELISAreader(SUNRISE-basicTECAN,TECANAustriaGmbh,Austria)读取培养后的混合物在570纳米下的光吸收值。.(7)以未处理细胞的吸收值相对于初始值的增长为增殖率100%。IC50表示导致50%细胞增殖的药物浓度。实验结果需要通过三次独立实验决定。3.试验结果本发明制备的化合物Chloropupukeananin对HeLa细胞和HT29细胞增殖抑制的IC5Q值分别为0.9、4.3〃g/mL，化合物PestalofoneC对HeLa细胞增殖抑制的ICs。值为1.2^g/mL。阳性对照物5-氟尿嘧啶的ICs。为5〃g/mLo结果表明本发明的Chloropupukeananin和PestalofoneC对HeLa细胞和HT29细胞的活性明显强于5-氟尿嘧啶的抑制活性。因此，本发明对研究与开发新的抗肿瘤(宫颈癌和结肠癌)药物提供了候选化合物，也为开发利用微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。ii权利要求1.生产抗肿瘤化合物的菌株，其菌株名为无花果拟盘多毛孢(Pestalotiopsisfici)N56，保藏号为CGMCCNo.2826。2.权利要求1的菌株，其中抗肿瘤化合物为Chloropupukeananin(1)或PestalofoneC(2)，结构式分别为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3.权利要求2的菌株，其中所述肿瘤为宫颈癌或结肠癌。4.生产抗肿瘤化合物的方法，所述方法包括用权利要求1的菌株进行发酵，从发酵产物中得到所述抗肿瘤化合物。5.权利要求3的抗肿瘤化合物，其为Chloropupukeananin(l)或，PestalofoneC(2)，结构式分别为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6.权利要求3的方法，其中所述肿瘤为宫颈癌或结肠癌。7.Chloropupukeananin或PestalofoneC用于制备抑制肿瘤的药物的应用。8.权利要求7的应用，其中所述肿瘤为宫颈癌或结肠癌。9.一种抗肿瘤药物，其包含Chloropupukeananin或PestalofoneC作为活性成分。10.权利要求9的药物，其中所述肿瘤为宫颈癌或结肠癌。全文摘要本发明涉及一株拟盘多毛孢属内生真菌(Pestalotiopsisfici)N56菌株及所产生的抗宫颈癌(HeLa)及结肠癌(HT29)活性化合物的发现及应用，属医药
技术领域：
。将无花果拟盘多毛孢(P.fici)菌株N56进行固体发酵，对发酵产物进行分离纯化得到活性化合物Chloropupukeananin和PestalofoneC，并利用质谱、核磁共振波谱等技术确定其结构。通过对化合物进行抗肿瘤活性评价，发现其具有显著的抗肿瘤活性。本发明对研究与开发新的抗肿瘤(宫颈癌及结肠癌)药物提供了备选化合物，并为开发利用真菌来源的天然活性物质提供了科学依据。文档编号A61P15/00GK101538537SQ20091007772公开日2009年9月23日申请日期2009年2月13日优先权日2009年2月13日发明者玲刘,车永胜,郭良栋申请人:中国科学院微生物研究所