Flip蛋白及其编码基因的新用途的制作方法

专利名称：：Flip蛋白及其编码基因的新用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种FLIP蛋白及其编码基因的新用途。胃思忟不FLIP(即FLICE-inhibitory-protein,也称为CASH，Casper,I-FLIP,CLARP,FLAME-1，MRTT)是近年来发现的一类含有死亡效应结构域(deathefectdomains,DED)的凋亡抑制蛋白，在病毒、真核生物、哺乳动物等许多物种中广泛存在。FLIP在结构与序列一匕与Caspase-8有很多相似之处，其过量表达能抑制胱天蛋白酶-8(caspase-8)的活化，阻止Caspase-8结合到死亡诱导信号复合物DISC上，从而阻断Fas介导的凋亡信号转导，有效降低机体各种疾病中病理状态下瞬间增强的细胞凋亡的发生。FLIP作为一种重要的凋亡抑制蛋白首先在病毒中被发现。九十年代初研究者们发现一些病毒(如Y-疱疹病毒、疣痘病毒等)含有一种可抑制细胞凋亡的基因，由这种基因表达的蛋白能保护受感染细胞不发生凋亡，使病毒得以复制。这种蛋白在结构上与FLICE(FADD-like-IL-lbeta-converting-enzyme/Caspase-8)相似，并能抑制FLICE的作用，故将它命名为FLIP，因它来源于病毒，所以又称为v-FLIP。1997年几个研究组又分别分离得到了v-FLIP的细胞类似物-cFLIP。FLIP蛋白在结构与序列上与Caspase-8有很多相似之处，其N-端含有与Caspase-8相似的两个相互串联的DED。每个DED含有40个氨基酸，DED与Fas(又叫AP01或CD95)的死亡结构域(deathdomain,DD)的功能相似，能介导蛋白质之间的相互结合。c-FLIP由于mRNA的差异拚接，形成cFLIPS和cFLIPL。cFLIPS只有2个DED，cFLIPL除2个DED外还含有一个caspase同源结构域，即caspase蛋白水解酶区域，但由于起催化作用的两个氨基酸残基Cys、His分别被Tyr、Arg所取代，没有酶活性。Perlman等发现，FLIP作为内源性凋亡负性调节剂在炎症时能表达增加，保护单核细胞不发生凋亡，并促进单核细胞分化为巨噬细胞，从而允许巨噬细胞的聚集，保证坏死细胞及有害物质被有效清除，促进炎症反应的发生。另外，机体组织发生缺血亦可出现无菌性炎症。Jin等发现，无血清培养时人的成纤维细胞内cFLIP/Caspase-8的比值升高，细胞凋亡水平降低，且Fas介导的NF-kB激活的敏感性增加，从而诱导IL-6，IL-8的转录及合成。而IL-6，IL-8是重要的炎症介质，据此推测缺血时FLIP参与了炎症的发生与调控。对FLIP研究的深入已使越来越多的学者认识到FLIP水平的变化与许多疾病的发生发展密切相关。
发明内容本发明的目的是提供一种FLIP蛋白及其编码基因的新用途。本发明提供的新用途是FLIP蛋白、FLIP蛋白的编码基因和/或含有FLIP蛋白的编码基因的重组表达载体在阻断FADD诱导的细胞凋亡中的应用。本发明还提供了FLIP蛋白、FLIP蛋白的编码基因和/或含有FLIP蛋白的编码基因的重组表达载体在制备阻断FADD诱导的细胞凋亡的药物中的应用。本发明还保护一种阻断FADD诱导的细胞凋亡的药物，它的活性成分是FLIP蛋白、FLIP蛋白的编码基因和/或含有FLIP蛋白的编码基因的重组表达载体。本发明提供的另一种新用途是FLIP蛋白、FLIP蛋白的编码基因和/或含有FLIP蛋白的编码基因的重组表达载体在抑制卵巢颗粒细胞凋亡中的应用。本发明还提供了FLIP蛋白、FLIP蛋白的编码基因和/或含有FLIP蛋白的编码基因的重组表达载体在制备抑制卵巢颗粒细胞凋亡的药物中的应用。本发明还保护一种抑制卵巢颗粒细胞凋亡的药物，它的活性成分是FLIP蛋白、FLIP蛋白的编码基因和/或含有FLIP蛋白的编码基因的重组表达载体。本发明提供的另一种新用途是FLIP蛋白、FLIP蛋白的编码基因和/或含有FLIP蛋白的编码基因的重组表达载体在促进动物繁殖性能中的应用。本发明还提供了FLIP蛋白、FLIP蛋白的编码基因和/或含有FLIP蛋白的编码基因的重组表达载体在制备促进动物繁殖性能的药物中的应用。本发明还保护一种促进动物繁殖性能的药物，它的活性成分是FLIP蛋白、FLIP蛋白的编码基因和/或含有FLIP蛋白的编码基因的重组表达载体。所述动物繁殖性能具体可为卵泡发育、卵泡数量、发情率、配种后胚胎个数和产仔率中的至少一种。所述FLIP蛋白可为牛FLIP蛋白。所述FLIP蛋白具体可为如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。所述FLIP蛋白的编码基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子1)其编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与l)或2)限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下杂交，然后用2XSSC,0.1。/。SDS和1XSSC,0.1%SDS各洗膜一次。所述FADD可为牛FADD蛋白。所述FADD蛋白具体可为如下(c)或(d)的蛋白质(c)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的由序列5衍生的蛋白质。本发明还保护一种重组表达载体，它包括敲除终止子的FLIP蛋白的编码基因。所述重组表达载体自上游至下游可依次包括阅读框相同的如下元件CMV启动子、敲除终止子的FLIP蛋白的编码基因、枯草芽孢杆菌复制子、大肠杆菌复制子和抗生素基因。所述重组表达载体具体可如序列表的序列3所示。将含有FLIP基因的重组质粒转染牛卵巢颗粒细胞后，转染后12h即可在荧光显微镜下观察到水母绿色荧光蛋白在细胞中表达。将重组质粒与pAcGFPbFADD共转染牛卵巢颗粒细胞，结果显示，共转染组卵巢颗粒细胞的体外增殖能力明显高于pAcGFP-bFADD转染组细胞；同时FCM检测显示共转染组巢颗粒细胞的凋亡率百分率显著低于pAcGFP-bFADD转染组。在卵母细胞发育过程中，Fas/FasL途径通过凋亡信号诱导卵巢颗粒细胞发生凋亡，失去对卵母细胞的支持、调节作用，进而使卵泡闭锁。FLIP的两个DED能与FADD结合，抑制其结合到DISC上,从而阻断了Fas介导的卵巢颗粒细胞凋亡信号转导，诱导卵巢颗粒细胞增殖，促进卵母细胞发育，维持卵泡发育的平衡状态，从而提高动物的繁殖性能。FLIP基因可通过阻断Fas/FasL途径中FADD诱导靶细胞凋亡，进而促进细胞增殖。FLIP能够明显抑制FADD诱导卵巢颗粒细胞凋亡，促进卵母细胞发育，减少卵泡闭锁，可作为有潜力的提高母牛繁殖性能的药物。本发明为增加母畜排卵率、提高母畜繁殖性能提供了较为可靠、具体的试验依据。抑制卵泡颗粒细胞凋亡，促进动物卵泡发育，在提高雌性动物繁殖性能方面具有广泛的应用前景。图l为带有BglII，EcoRI克隆位点的牛FLIP基因电泳图。图2为pAcGFP-bFLIP质粒的鉴定。图3为pAcGFP-bFLIP质粒部分序列测定图。图4为融合蛋白在牛卵巢颗粒细胞中的荧光表达。图5为pAcGFP-bFLIP质粒转染的牛卵巢颗粒细胞中FLIPmRNA的表达鉴定图。图6为pAcGFP-bFLIP质粒转染的牛卵巢颗粒细胞中FLIP蛋白的电泳鉴定图。图7为pAcGFP-bFLIP质粒转染的牛卵巢颗粒细胞中FLIP蛋白的Western鉴定图。图8为实施例4中不同处理的0D值。图9为实施例4中不同处理的细胞周期变化及凋亡峰。图10为不同处理的小鼠的卵巢中FLIPrnRNA的表达量。图11为不同处理的小鼠的血清中FSH的浓度。图12为实施例2的步骤二中降落PCR的反应程序示意图。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例l、牛FLIP基因的克隆一、牛卵巢总RNA提取及cDNA合成无菌摘取健康母牛的卵巢，迅速置于液氮中，用Trizol法提取总RNA，紫外分光光度计测定其^f直，将巡6。/巡w,〉1.8的RNA置于-7(TC备用。采用TaKaRa公司的反转录试剂盒进行反转录合成cDNA。二、PC財广增目的基因根据牛FLIP基因全长cDNA序列(GenBankAccessionNumber:NM—001012281)，设计特异性引物对甲如下上游引物5'-TTCCTTGGAATGACACTGTA-3';下游引物5'-CTTTTTATTTGTGAGAGAGG-3'。引物由北京赛百盛生物工程公司合成。采用该特异性引物对，以步骤一合成的cDNA为模板进行PC財广增。PCR反应体系(20ul):10Xbuffer(含20(amol/LMg2—)2.0u1，10mol/LdNTPs0.4ul，10mol/L的上、下游引物各0.6y1，模板DNA1yl，2U/p17邵DNA聚合酶O.3u1，超纯水15.1u1。反应程序94°C90s;94°C30s、52°C30s、72°Clmin，35个循环；72。C延伸10min。0.8、/。的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，用DNA回收试剂盒纯化回收。将PCR产物进行测序，结果表明1483bp的PCR产物含有FLIP基因的CDS区编码序列(GenBankAccessionNumber:NM—001012281自5'末端第38至1492位核苷酸)。FLIP基因的CDS区编码序列全长1455bp(见序列表的序列l)，编码具有484个氨基酸残基氨基酸序列(见序列表的序列2)。FLIP蛋白分子量为55.6KDa，等电点为7.19。三、目的基因的克隆1、将l.OPL纯化后的PCR产物与O.5yLpMD19-T质粒(TaKaRa公司，产品货号D102C)于16。C连接6h。2、将5uL连接产物加入200yLDH5a感受态细胞中，冰浴30min,42。C热激90s，冰浴5min使DNA转化感受态细胞。3、向DH5a感受态细胞中加入800wL液体LB培养基于37°C、200r/min、摇菌60min,使菌体分裂增殖。4、3600r/min，离心2min，弃800uL上清液，混匀，取菌液涂布于含氨苄青霉素(sigma公司，货号A6140)的LB培养板。37°C、培养10h。5、挑取阳性菌落于含氨卞青霉素的液体LB培养基中，37°C、200r/min、摇菌2h。6、以菌液作为模板，采用特异性引物对甲进行PCR扩增。并挑取条带好的菌液送北京诺赛基因组研究中心进行序列测定分析。结果表明，获得了含有将FLIP基因的CDS区编码序列的pMD19-T质粒，将其命名为pMD19T-FLIP。实施例2、重组质粒(pAcGFP-bFLIP)的构建及鉴定一、带酶切位点特异性引物的设计根据牛FLIP基因的酶切图谱和pAcGFP-Nl的多克隆位点，选用餘7II和化。RI作为克隆位点。从FLIP基因的完整阅读框序列的两端设计引物上游引物5'-ACTAGATCTGCCACCATGTCTGCTGAAGTCAT-3，；下游引物5'-ACTGAATTCTTTGTGAGAGAGGAAGA-3，。上游引物在ATG前加入3^/11酶切位点和四个保护性碱基，同时加入Abzi序列7以提高插入的基因在真核细胞中起始转录和表达的效率。下游引物设计时删除牛FLIP基因的终止密码子TAA，并在其后加入一个C碱基和fcoRI酶切位点，使FLIP阅读框与下游的AcGFP基因序列保持一致，保证FLIP与报告基因融合后能够同时表达。下划线分别为酶切位点，波浪线为Abzi序列。二、目的基因的扩增、酶切、连接及转化1、以pMD19T-FLIP质粒为模板，采用步骤一的引物进行降落PCR。PCR反应体系(20uL):10Xbuffer(含20mol/LMg2+)2.0uL，10mol/LdNTPs0.4uL，10mol/L上、下游引物各O.6nL，质粒DNA1uL，2U/uLTag腿聚合酶0.3yL，超纯水15.1uL。反应程序见图12。PCR产物的电泳图见图1。图l中，M:marker;1-5:PCR产物。获得PCR产物的长度为1477bp，与预期结果相符。利用凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，将其克隆到pMD19-TSimple载体(TaKaRa公司，产品货号:D104C)，转化DH5a宿主菌，提取质粒，用限制性内切酶和I双酶切，0.8%琼脂糖凝胶纯化回收到1496bp的FLIP片段。2、用限制性内切酶5^II和fcoRI双酶切pAcGFP-Nl质粒(Clontech公司，货号632469)，纯化回收约4726bp的pAcGFP-Nl片段。3、将步骤1回收的约1496bp的FLIP片段和步骤2回收的约4726bp的pAcGFP-Nl片段用T4DNA连接酶于16'C连接7h，然后将连接产物接种于含有30ng/mL卡那霉素的固体LB培养基平板，37。C培养过夜，蓝白斑筛选阳性克隆，进行步骤三的鉴定。三、重组质粒的鉴定1、酶切鉴定用小量质粒抽提试剂盒提取质粒进行酵切鉴定。结果见图2。图2中，M:markerDL5000;14:pAcGFP-bFLIP质粒5g7n/5boRI双酶切;5:未酶切pAcGFP-bFLIP质粒。质粒进行i^ill和AcdI双酶切后，显示4.7kb的线性载体片段和1477bp的FLIP基因片段。鉴定结果表明表明目的基因己正确插入pAcGFP-Nl载体中，获得了目的质粒。2、测序鉴定选取酶切鉴定正确的质粒送北京诺赛测序公司进行测序。质粒的测序结果见序列表的序列3。该质粒中，自上游至下游依次为如下元件1589位为CMV启动子、第621位至2837位为融合蛋白基因(缺失终止密码子的牛FLIP基因位于绿色荧光蛋白报告基因AcGFP的上游，两个基因具有相同阅读框，组成融合蛋白基因，融合基因的示意图见图3，该基因编码序列表的序列4所示的融合蛋白，融合蛋白中第1484个氨基酸为FLIP多肽，第499739个氨基酸为AcGFP多肽)、第3219位至3525位为枯草芽孢杆菌复制子、自3883位至3960位为大肠杆菌复制子、自4070至4858位为原核生物遗传选择标记卡那霉素抗性Knf和真核生物筛选标记新霉素(G418)基因。将该质粒命名为pAcGFP-bFLIP。实施例3、重组质粒(pAcGFP-bFLIP)在牛卵巢颗粒细胞中的表达1、pAcGFP-bFLIP质粒的提取将pAcGFP-bFLIP质粒在DH5a中扩增，以无内毒素超纯质粒抽提试剂盒(北京天根生化公司，货号DP117)制备不含内毒素的pAcGFP-bFLIP,-2(TC保存。2、牛卵泡颗粒细胞的分离、纯化及培养①将从屠宰场获得牛卵巢用PBS反复冲洗后，用2ml注射器吸取卵泡中的细胞于培养皿中，除去卵母细胞。②用巴斯德管收集颗粒细胞团，用新鲜DMEM/I^清洗三次以除去红细胞(200g/min,离心5min)。③颗粒细胞重悬于DMEM/FJ咅养基中，37°C、5%0)2孵箱中孵育15min。④然后用DMEM/Ft2培养液洗涤细胞2次(250g/min，离心5min)。⑤用0.2%台盼蓝测定细胞活力。用含10%体积百分含量的FBS(invitrogen公司，货号16000-044)、15mmol/LHEPES(invitrogen公司，货号15630-106)、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素(invitrogen公司，货号15140-148)的DMEM/Fj咅养基(invitrogen公司，货号11039-047)稀释并计数细胞密度，以4X106cells/ml接种于培养皿，37°C、5%C02，完全湿度条件下培养。3、用pAcGFP-bFLIP质粒转染牛卵巢颗粒细胞①转染前一天，将牛卵巢颗粒细胞以5X107ml的密度加入无抗体的DMEM/Fj咅养基中，接种于12孔板中。②待细胞达到90。/。融合时，将DMEM培养基换为Opti-MEMIReducedSerumMedium(invitrogen公司，货号31985-070)培养基，准备进行转染。③将4u1Lipofectami2000加入100ix1Opti—MEMIReducedSerumMedium培养基中，室温孵育5rain;接着将3.2ul浓度为800ng/mL的pAcGFP-bFLIP质粒加入IOOu1Opti-MEMIReducedSerumMedium培养基中轻轻混匀;将两种溶液温和混合并于室温孵育20min。将200yl步骤③得到的混合液加入含有细胞和培养基的孔中，于37。C、5%C02、培养46h后，更换含10%FBS的DMEM培养基继续培养。并于转染24h后加入G418，以600ug/ml的浓度进行筛选。试验中，设置两个对照。对照一用DMEM培养基代替转染用的质粒；对照二转染pAcGFP-Nl空载体。每个处理设置5个复孔。转染后从12h开始，每隔24h在荧光显微镜下观察细胞形态及细胞中水母绿色荧光蛋白的表达情况。转染pAcGFP-bFLIP质粒的细胞中转染24h后即可观察到牛卵巢颗粒细胞有绿色荧光表达，绿色荧光大多数分布于细胞核及其周围，阳性细胞所占的比例可达65%，转染效率较高。转染后72h时，融合蛋白在牛卵巢颗粒细胞中的表达情况见图4，图4中，A、B、C为荧光显微镜下观察的转染牛卵巢颗粒细胞的照片；D、E、F为光镜下观察的转染牛卵巢颗粒细胞的照片。其中A、D为DMEM培养基空白对照组(对照一)；B、E为pAcGFP-bFLIP质粒转染组；C、F为pAcGFP-Nl空载体转染组(对照二)。对照一中转染细胞在荧光显微镜下不能观察到任何绿色荧光；对照二中转染后的牛卵巢颗粒细胞呈现很强的绿色荧光，并且均匀的分布于整个细胞内。卵巢颗粒细胞经G418筛选10d后，收集细胞。用TrizolReagent提取细胞总RNA进行RT-PCR检测。结果见图5。图5中，M:marker;1:对照一；2:转染pAcGFP-bFLIP质粒的细胞；3:对照二。转染pACcGFP-Nl-bFLIP质粒的细胞电泳后出现1477bp的高亮度目的条带，而对照一和对照二在1477bp处的条带则相对较弱，表明转染pACcGFP-bFLIP的牛卵巢颗粒细胞中的FLIP基因进行了高效转录。卵巢颗粒细胞经G418筛选10d后，收集细胞。加入lmlRIPAbuffer和10n1PMSF(IOmg/ml)裂解细胞，提取细胞总蛋白，用Bradford比色法测定蛋白浓度。提取得到的总蛋白SDS-PAGE后电转硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭，与兔抗牛FLIP多克隆抗体(santacruz公司，货号sc-5276)和HRP酶标二抗(北京博奥森生物技术有限公司bse-0326R)反应后，ECL化学发光试剂盒检测融合蛋白的表达。总蛋白SDS-PAGE电泳结果见图6。图6中，M:marker;1:对照一；2:对照二；3、4:pAcGFP-bFLIP质粒转染组。转染重组质粒pAcGFP-bFLIP的细胞总蛋白在PAGE胶上电泳产生大小约为83kD的融合蛋白条带，初步证实FLIP融合蛋白基因已在卵巢颗粒细胞中得到表达。Westernblot检测结果见图7。图7中，1:转染pAcGFP-Nl空载体对照组；.2:转染pAcGFP-bFLIP质粒的细胞。结果表明，转染pAcGFP-bFLIP质粒的细胞中，表达产物能与FLIP抗体结合并在NC膜上产生特异性反应条带，表达产物为具有免疫活性的FLIP蛋白。pAcGFP-Nl质粒对照组为阴性结果。实施例4、FLIP对FADD的抑制作用一、pAcGFP-bFADD的获得1、牛FADD基因的扩增设计如下引物，扩增两端带有BglII和EcoRI酶切位点的牛FADD基因上游引物5'-ACTAAGATCTGCCACCATGGACCCGTTCCTGGT-3';下游引物5'-ACTAGAATTCCGGAGGCTCCCGGGGCAGCG-3'。以牛基因组DNA为模板，采用降落PCR方法进行扩增。PCR反应体系(20uL):10Xbuffer(含20mol/LMg2+)2.0uL，10mol/LdNTPs0.4nL，10mol/L上、下游引物各0.6uL，质粒DNA1nL，2U/uLTaqDNA聚合酶0.3uL，超纯水15.1uL。反应程序94°C90s;94°C30s，退火温度分别为70°C、68°C、66。C各30s，72。C1min，最后28个循环；72。C延伸10min。获得654bp的FADD基因，纯化、回收。2、pAcGFP-bFADD的构建用限制性内切酶^ill和^boRI双酶切pAcGFP-Nl质粒(Clontech公司，货号632469)，纯化回收约4726bp的pAcGFP-Nl片段。将步骤1回收的654bp的FLIP片段和约4726bp的pAcGFP-Nl片段用T4DNA连接酶于16。C连接7h，然后将连接产物接种于含有30ng/mL卡那霉素的固体LB培养基平板，37。C培养过夜，蓝白斑筛选阳性克隆，提取质粒进行测序鉴定。结果表明，质粒的序列见序列表的序列6，将含有FADD基因的pAcGFP-Nl质粒命名为pAcGFP-bFADD。二、FLIP对FADD的抑制作用1、MTT法测定FLIP与FADD基因共转染卵巢颗粒细胞后对细胞体外增殖能力的影响试验分为五组包括空白对照组、pAcGFP-Nl质粒转染组、pAcGFP-bFADD质粒转染组、pAcGFP-bFADD/pAcGF-bFLIP质粒共转染组、pAcGFP-bFADD/pAcGFP-Nl质粒共转染组。牛卵泡颗粒细胞的分离、纯化及培养同实施例3。1)收集指数生长期的卵泡颗粒细胞，用DMEM培养基调整细胞密度为lX107ml，于96孔培养板每孔加IOOul，37°C、5%C02条件下孵育12h后，弃上清。2)在加入细胞的96孔培养板中，分别进行如下处理，每个处理设置18个复孔处理一(空白对照组)力口50ul无血清DMEM;处理二(FADD组)加50ulpAcGFP-bFADD质粒/LipofectaraiTM2000复合物，其中含有2.4ug的pAcGFP-bFADD质粒和3.0nLLipofectami2000;处理三(pAcGFP-Nl组):加50ulpAcGFP-Nl质粒/LipofectamiTM2000复合物，其中含有2.4ug的pAcGFP-Nl质粒和3.0uLLipofectami2000;处理四(FADD/FLIP组)力口50ylpAcGFP-bFADD/pAcGFP-bFLIP质粒/Lipofectami2000复合物，其中含有L2ug的pAcGFP-bFLIP质粒、1.2ug的pAcGFP-bFADD质粒和3.0uLLipofectami2000;处理五(FADD/pAcGFP-Nl组)加50u1pAcGFP-bFADD/pAcGFP-Nl质粒/Lipofectami2000复合物，其中含有l.2ug的pAcGFP-bFADD质粒、1.2ug的pAcGFP-Nl质粒和3.0uLLipofectami2000;3)37°C、5%C02条件下孵育4h后，吸弃上清，补加200n1含10%胎牛血清的DMEM，随后分别于0、24、48、72、96、120h每孔加MTT(5mg/ml)10y1，继续孵育4h后，小心吸弃上清，加入DMSO200lU/孔，低速振荡IOmin，充分溶解甲臜结晶后，在酶联免疫检测仪上测汉U值。以6^。值为纵坐标，时间(h)为横坐标绘制生长曲线。抑制率=(对照组^1-实验组0"直)/对照组6^直，计算细胞生长抑制率。通过对各组细胞活率分析，pAcGFP-bFADD/pAcGF-bFLIP质粒共转染组细胞的体外增殖能力明显高于FADD/pAcGFP-Nl质粒共转染组细胞，见图8。2、FCM分析FLIP与FADD基因共转染卵巢颗粒细胞后细胞的周期分布及凋亡情况三组牛卵巢颗粒细胞，每组5X10e细胞。第一组细胞用pAcGFP-bFADD进行转染，转染量为2.4ug;第二组细胞用pAcGFP-bFADD/pAcGFP-bFLIP进行共转染，12pAcGFP-bFADD的转染量为1.2ug，pAcGFP-bFLIP的转染量为L2ug;第三组细胞用pAcGFP-Nl进行转染，转染量为2.4ixg。每组设三个重复。转染后的牛卵巢颗粒细胞培养5(1，0.05%胰蛋白酶消化，冷PBS洗2次，4'C、200g/min离心5min，弃上清液，细胞沉淀用O.3mL含8。/a胎牛血清的PBS混匀，缓慢加入-2(TC预冷的无水乙醇，使其终浓度为70%，于4。C固定12h。离心洗涤细胞，用0.5ml浓度为lmg/ml的RNaseA悬浮细胞，37°C、孵育30min，再加入O.5ml浓度为50ng/mlPI染液，4"C避光染色10min，流式细胞仪检测细胞周期变化及凋亡峰。结果显示，共转染组巢颗粒细胞的凋亡率百分率显著低于pAcGFP-bFADD转染组，见图9。图9中，A:pAcGFP-Nl转染组;B:FADD转染组;C:FADD/FLIP转染组。实施例5、FLIP对卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用和对卵泡发育和产仔率的促进作用pAcGFP-bFLIP质粒的提取将pAcGFP-bFLIP质粒在DH5a中扩增，以无内毒素超纯质粒抽提试剂盒(北京天根生化公司，货号DP117)制备不含内毒素的pAcGFP-bFLIP表达载体，于-2(TC保存备用。将提取的质粒用紫外分光光度计测定0D260和OD280的值，质粒的浓度为1.135mg/mL，0D260/0D280为1.89，表明提取的质粒DNA纯度较好，没有蛋白污染，也没有发生降解。将提取的pAcGFP-bFLIP质粒用AcoRlA^2II进行酶切分析。经酶切和电泳分析，质粒中包含约1477bp的FLIP基因。试验动物及饲养环境150只35日龄ICR雌性小鼠、50只45日龄ICR雄性小鼠饲养于SPF级转基因小鼠试验动物房。饲养条件温度22-28°C，相对湿度40%-60%，噪音〈60dB，昼夜明暗交替时间为12h/12h，饲养室内每天经紫外灯照射2h杀菌，饲料饮水均灭菌处理，鼠笼和垫料每周更换两次。小鼠于试验前预饲养l周，将150只雌性小鼠分为3组(空白对照组、pAcGFP-Nl质粒转染组、pAcGFP-bFLIP质粒转染组)。先于每只雌性小鼠的左右两侧腓肠肌各注射50uL0.25%盐酸布比卡因，然后于24h后分别肌肉注射100ugpAcGFP-FLIP、lOOixgpAcGFP-Nl,100uL生理盐水。2周后再加强注射一次。于第2次质粒转染后的第10天开始进行如下试验一、FLIP对卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用每组随机取10只小鼠，脱颈法处死小鼠，取出两侧卵巢，将一侧卵巢用液氮冻存，进行荧光定量PCR分析FLIPmRNA的表达情况。结果表明，pAcGFP-FLIP转染组13小鼠卵巢中FLIPmRNA的表达量显著高于空白对照组和pAcGFP-Nl空质粒转染组，见图10;另一侧的卵巢用胰蛋白酶和胶原酶V消化分离卵泡颗粒细胞，用Hoechest33342荧光染色检测细胞凋亡情况。结果显示，pAcGFP-FLIP质粒转染组小鼠卵巢颗粒细胞平均凋亡率为(3.19±0.48)%，显著低于pAcGFP-Nl质粒转染组卵巢颗粒细胞平均凋亡率(11.53士0.76)%和空白对照组卵巢颗粒细胞平均凋亡率(13.41±1.27)%(P<0.01)。二、FLIP对动物卵泡发育和产仔率的促进作用第2次质粒转染后的第10天开始进行如下指标检测①观察一周内各组小鼠发情的情况(阴道涂片法)；②每组随机取10只发情周期的小鼠，在动情期脱颈法处死小鼠，取出两侧卵巢，放大镜下统计卵巢上成熟卵泡(MF)的个数；③将每组10只雌性小鼠与雄性小鼠于每日下午4-5点合笼，次日上午8-9点钟检查阴道栓，每组抽取10只小鼠，脱颈法处死小鼠，取出小鼠的输卵管壶腹部，置于PBS中，在解剖镜下分离出胚胎细胞团，加入少许透明质酸酶分离胚胎，统计每只小鼠两侧输卵管中的胚胎；④各组小鼠注射质粒后10天采血，离心取血清，测定促卵泡激素(FSH)的浓度；⑤其余的小鼠配种后，待分娩后统计窝产仔数及初生重。结果显示，小鼠连续两次转染质粒后，各组小鼠血清中FSH的浓度出现不同的变化空白转染组FSH的浓度平均为1L91IU/L，pAcGFP-N1空质粒组FSH的浓度平均为13.12IU/L，均低于pAcGFP-FLIP质粒组的FSH浓度(27.03IU/L)，见图ll。同时对各组小鼠发情率、成熟卵泡数、配种后胚胎数、平均窝产仔数和平均初生重等指标检测结果表明，pAcGFP-FLIP质粒组在发情率、胚胎数、窝产仔数方面均高于阴性对照组和pAcGFP-Nl空质粒组。在初生重方面三个实验组差异不显著，如表1所示。以上试验结果表明FLIP对促进动物卵泡发育，提高产仔率具有重要作用。表l各组小鼠繁殖性能相关检测指标数据<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>序列表<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所<120>FLIP蛋白及其编码基因的新用途<130>CGGNARY92052〈160〉6<210〉1〈211〉1455〈212〉DNA<213〉牛科牛(Aosz^〃r〃s)atgtctgctga^gtcgLtccatc3ggta^gaagaagcacttgga3gg3taca60ctcctttttttgtgccg卿tgttgctgcagatgtggttccactgaatgtcagggatctt120ctggatatttagga^gctgtcttctgtgagcttggctgagctgctctac180卿gtgglggCggtt"tgacttgctca卿gggtcttg犯tatggataccccgacagtggag240gccctcctgcgcaagcacccacatctgatttca^ctstagggtgctgatgatggeigatt300ggtgaggatttggataa^tctgacgtgtcctcattaatgttcctcatgag3g3ttatacg360ggtcgaagcaggataagagtttcttggatcttgtggttga3ttgg卿ag420ctaaatctggttgctccagatc肌ctgaattta"ttag犯gaaagcctaaggaacatcaac480aggatagacctgaagacaaaa^tcca^gaaatacaagcagtcagctcaagg3gcgg犯3ca540aatt^tgtaaatgctcgccaggcatctctgCC￡L￡L￡LCt1:g3gtgtta肌gatccttcatat600^cctaaggctccsgaatggga3caaaggcttatgatgggaccacctgac660attca^aga^g犯ccagtgd3gagacccattcaggaatcaggagcatttttgcctcagcac720atagi:3g^gagagatataagatgcagagcaagcccctgggaatctgcctgataattgac780tgcattggcaatg3cac3g3cattcttcgggacaccttcacttccctgggctatgaagtc840aagcatttcttatatctcac"tgtga^gatataaccaacattxtacgccaagttgcccag900atgccccagcaccaagactxtgacagctttgcgtgtatcctggtgagccgagggggctcc恥Oc卿gcgtgtttggcgtggatcagactcactctggggtccctttggatcatatcagaaga1020atgttcatggcccctctctctcsgggaagccaaagctcttttttattcag1080agctatgtgaaatcagagggccagctggaggacagcagcttcctggaggtggacgggccg1140tcagtgaaaagtgcagactccaaggccagacagcctgggccctaccaagatttgattcac1200cgagaagctgacttcttctggagcctgtgcaaagcagatgtgtccctgctggaggggccc1260tccagctcaccctcattgtacctgaagtgcctctcccagaaactgtggaaagaaagaaag1320■cactcgctcctggaactccacactgaactcaaccgcctggtgtatgsttggaacagcaaa1380gtgtctgctaaggagcgatactatgtctggctgcagcacactttgagaaagaatctcttc1440ctctctcacaaataa1455<210〉2〈211〉484〈212〉TOT〈213〉牛科牛(5osfa〃/7AS)<400>2MetSerAlaGluVallieHisGinValGluGluAlaLeuAspGluGlu151015GluLysAspThrLeuLeuPheLeuCysArgAspValAlaAlaAspVal202530ValProLeuAsnValArgAspLeuLeuAsplieLeuArgGluArgGly354045LysLeuSerSerValSerLeuAlaGluLeuLeuTyrArgValArgArg505560PheAspLeuLeuLysArgValLeuAsnMetAspThrProThrValGlu65707580AlaLeuLeuArgLysHisProHisLeulieSerAspTyrArgValLeu859095MetMetGlulieGlyGluAspLeuAspLysSerAspValSerSerLeu100105110MetPheLeuMetArgAspTyrThrGlyArgSerLyslieAlaLysAsp115120125LysSerPheLeuAspLeuValValGluLeuGluLysLeuAsnLeuVal13013514016Ala145ArgGlyLeu'SerPro225lieLeuPheLysGin305GinHisLysLeuAla385ArgProlieAlaSerLys210ValVallieThrAsp290AspSerlieProGlu370AspGluAspAspGluVal195GluLysGlulieSer275lieSerValArgLys355AspSerAlaGinLeuThr180LysGinArgGluAsp260LeuThrAspPheArg340LeuSerLysAspLeuLys165AsnAspArgProArg245CysGlyAsnSerGly325MetPheSerAlaPheAsn150ThrTyrProLeulie230Tyr"MoJL丄LTyrliePhe310ValPhePhePheArg390PheLeuLysValSerMet215GinLysm，rvj丄)GluLeu295AlaAspMetlieLeu375GinTrpLeulieAsnTyr200MetGluMetAsnVal280ArgCysGinAlaGin360GluProSerGluGinGluLys170ArgSer155TyrGinLeuLysAlaAla185AsnLeuArgLeuGlyProProSerGlyGinAsp265LysGinlieThrAsp345SerValGlyLeuSer250ThrHisValLeuHis330ThrTyrAspProCysAlaVal315SerCysValGlyTyr395LysAsp220PheArgGinSerGin205lieAsplieLeuPheLeuGin300SerGlyProLysPro380GinAlaAsnSerLeu190AsnGinlieAsn160AlaGin175ProAsnGlyArgArgGluAla235LysProLeuGlyLeuProGinHis240lieCys255AspThrTyr285MetArgValSerSer365SerAspAspArg270LeuProGlyProLeu350GluValLeuValThrValGinHisGlySer320LeuAsp335SerGlyGlyGinLysSerlieHis400SerLeu17405410415LeuGluGlyProSerSerSerProSerLeuTyrLeuLysCysLeuSer420425430GinLysLeuTrpLysGluArgLysHisSerLeuLeuGluLeuHisThr435440445GluLeuAsnArgLeuValTyrAspTrpAsnSerLysValSerAlaLys450455460GluArgTyrTyrValTrpLeuGinHisThrLeuArgLysAsnLeuPhe465470475480LeuSerHisLys〈210>3<211〉6171〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223><400〉3tagttattaatagtaatcaattacggggtccgttacataacttacggtaaatggcccgccgacgtc肪taatgacgtatgttcccatagt3tggg"tggsgtstttscggt肌3ctgcccaaagtacgccccctattgacgtcaatgacggcatgaccttatgggactttcctacttggcacatggtgatgcggttttggcagtacatcaaatttccaagtctccaccccattgacgtcaaggactttccaaaatgtcgtaacaactccgcacggtgggaggtctatataagcagagctggccggactcagatctgccaccatgtctgctgatg肌geigg3ga^agg3t3cactccttttttattagttcatagcccatatatggagttccg60tggctgaccgCCCa3Cg3CCcccgcccatt120a^cgcc犯tagggactttccattgacgtca180cttggcagtacatcaagtgtatcatatgcc240taaMggcccgcctggcattatgcccagta300gtacatctacgtattag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