专利名称：抗卵圆形糠秕孢子菌igy及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗卵圆形糠秕孢子菌(Pityrosporum ovale)的抗体和它的用途。更具体地，本发明提供一种生产该抗体的方法，该方法是通过从卵圆形糠秕孢子菌分离出特异蛋白质，采用该蛋白质使动物产生免疫，并从动物获取抗卵圆形糠秕孢子菌的抗体；抗卵圆形糠秕孢子菌IgY用于预防或治疗由卵圆形糠秕孢子菌引起的头皮屑和脂溢性皮炎，卵圆形糠秕孢子菌是引起头皮屑和脂溢性皮炎的原因。
背景技术：
卵圆形糠秕孢子菌是亲脂性酵母菌，它是正常人体皮肤上，特别是头皮上正常菌群的一员。卵圆形糠秕孢子菌涉及几种皮肤病，特别是头皮屑和脂溢性皮炎。如果卵圆形糠秕孢子菌对正常菌群的比例是74％或更大，随着这一数量将表现出头皮屑症状，并引起瘙痒。当比例达到83％或更大时，脂溢性皮炎将会发作(Shuster，S.Br，J.Dematol，3，235(1984)；McGinley，K.J.等J Invest.Dermatol.64，40(1975))。当头皮屑为异常状态的情况下，卵圆形糠秕孢子菌的形式是菌丝而不是菌孢子的形式，这使得治疗更加困难。因此，头皮屑病情变成慢性的(Mycos 199740 suppll29-32)。
为改进皮肤状况，已经使用包括防头皮屑的组分如酮康唑(Ketoconazole)、巯氧吡啶锌(Zinc Pyrithion)、甘宝素(Climbazole)和其它产品。然而，这些产品的组分对卵圆形糠秕孢子菌的特异性较低，因此在杀死卵圆形糠秕孢子菌的同时也将有用的微生物杀死了。因此，非常可能的是在脂溢性状态下，卵圆形糠秕孢子菌成为头皮中的主要微生物。
先前有几种采用抗体，特别是卵黄抗体除去病原微生物的例子。典型的例子是抗痤疮细菌的抗体，和诱导牙齿腐蚀的细菌(韩国专利未决公开No.1997-73607)。此外，韩国专利未决公开No.2000-49499公开了使用保持抗幽门缠绕杆菌(Helicobacter pylori)抗体效价的主体卵黄液体和希望用于预防通常的微生物和酵母污染的发酵奶的制备方法。同样，发酵奶是市售的(KOREA YAKURT Co.，韩国)。然而，迄今为止还没有介绍与卵圆形糠秕孢子菌有关的产品或抗体。
发明内容
发明概述本发明提供一种抗卵圆形糠秕孢子菌IgY，一种IgY的生产方法，和抗卵圆形糠秕孢子菌IgY用于预防和治疗由卵圆形糠秕孢子菌引起的头皮屑或脂溢性皮炎的用途。通过从卵圆形糠秕孢子菌分离特异性蛋白质，采用特异蛋白质使产卵母鸡产生免疫，然后从卵黄分离抗体而生产IgY。
发明详述本发明涉及一种抗卵圆形糠秕孢子菌抗体，和它的用途。更具体地，本发明涉及使用该抗体以消除头皮屑和治疗脂溢性皮炎，其中该抗体的生产是通过从卵圆形糠秕孢子菌分离特异性蛋白质，采用该蛋白质使产卵母鸡产生免疫，并在卵黄中获得抗体。
与先前技术相比，本发明使用抗卵圆形糠秕孢子菌抗体的制备方法，用于抑制卵圆形糠秕孢子菌增殖或抑制一些卵圆形糠秕孢子菌分泌的酶，卵圆形糠秕孢子菌在皮肤或头皮上，通常引起并恶化头皮屑、脂溢性皮炎和特异反应性皮炎。由于抗体自身是从食用蛋分离的生物大分子，与化学抗真菌剂或激素相比不具有有害效果。因此，它是一种预防和治疗头皮屑、脂溢性皮炎和特异反应性皮炎的安全材料。
根据本发明，抗卵圆形糠秕孢子菌抗体的制备方法包括如下四个步骤1.制备抗卵圆形糠秕孢子菌的抗原；2.采用抗原使产卵母鸡产生免疫以生产含有抗卵圆形糠秕孢子菌IgY的卵黄；3.分离IgY；和4.制备包括抗卵圆形糠秕孢子菌的IgY的组合物。
本发明的抗体的制备是通过采用抗原(如卵圆形糠秕孢子菌)使动物产生免疫，从动物的血液或卵获得抗体。可用于本发明的动物包括哺乳动物(如兔子)，和家禽。优选使用鸡、鸭和火鸡，更优选产卵母鸡。注射抗原和获得抗体的方法对本发明涉及的相关领域中的技术人员是公知的。
在本发明的优选实施方案中，抗原可以是卵圆形糠秕孢子菌的粗提取物或纯化的细胞壁组分。有报导，卵圆形糠秕孢子菌在细胞壁中含有独特的37KD和67KD蛋白质，而在其它酵母菌中没有发现这些蛋白质。试验结果显示抗独特蛋白质的单克隆抗体与卵圆形糠秕孢子菌的结合活性为90％或更大(Zargari.A等，Clin Exp Allergy 1997，5月，2795；584-92页)。因此，本发明的发明人使用卵圆形糠秕孢子菌的粗提取物和细胞壁的组分作为抗原。
在家禽的血液中，存在数量分别为5.0mg，1.25mg和0.61mg每ml血清，对应于哺乳动物IgG，IgM和IgA的免疫球蛋白。产卵家禽具有通过被动免疫向小鸡转移免疫组分的特性。结果是，抗体可以在卵中积累。三种免疫球蛋白中仅有IgG保留在卵黄中，因此它称为IgY(免疫球蛋白卵黄)。IgY的浓度是约25mg每ml卵黄，它已知为优异的多克隆抗体。
与其它从哺乳动物获得抗体的方法相比，从产卵母鸡获得特异抗体有很大的优点。即，单个卵可含有约90-100mg抗体，这与从兔子提取的血液中包含的数量相当。收集产生免疫的鸡的卵比从哺乳动物抽取血液更容易，并且收集卵并不需要牺牲动物。此外，由于容易促进免疫鸡的大规模饲养，可以生产更多的抗体。
特别地，可以采用约40kg每年的数量生产产卵母鸡的IgY，该数量是用兔来生产的120倍。由于在家禽和哺乳动物之间的系统发育的差异，家禽的IgY并不需要与哺乳动物IgG交叉反应，它对于生产哺乳动物抗原特异的IgY是非常有用的。最重要的是，通过使用生产抗体的产卵母鸡，可以重复生产稳定的活性抗体，因此使标准化制造工艺和研究开发产品成为可能。
本发明的特性在于使用含有抑制卵圆形糠秕孢子菌增殖的抗体的卵作为有效组分制备用于消除头皮屑或脂溢性皮炎的组合物。
根据本发明的抗原可以由肌内、皮下、静脉内、腹腔或口服给药。其中，优选是肌内注射。按照抗原中的蛋白质含量，给药抗原的剂量可以为10μg或1mg，同时还依赖于动物的条件或状况。重复注入抗原直到抗体的数量达到最大值，该最大值可以由卵黄中特异抗体数量的转变来检验，由ELISA(酶联免疫吸附测定)方法检验。
根据本发明的抗体可以从上述卵中用分离抗体的通常方法分离。卵自身可以在干燥和粉末化之后用作抗体，它进一步包括整个卵粉、卵黄粉和水溶性卵黄蛋白质粉。可以从卵黄精制抗体。纯化的抗体可用于制备药物组合物，该药物组合物用于预防和治疗由卵圆形糠秕孢子菌引起的皮肤疾病，特别是防头皮屑和脂溢性皮炎。
为检验抗卵圆形糠秕孢子菌抗体预防和治疗头皮屑、脂溢性皮炎和特异反应性皮炎的效果，采用香波和外用配方，将测试应用于具有皮肤疾病如头皮屑或脂溢性皮炎和特异反应性皮炎的一些人。结果是，抗卵圆形糠秕孢子菌的卵黄抗体可以抑制糠秕孢子菌属的生长和活性，用作预防和治疗头皮屑和脂溢性皮炎的有效组分。
以下实施例仅用于说明本发明而不限制由权利要求确定的本发明范围。
具体实施例方式
实施例1卵圆形糠秕孢子菌的培养将卵圆形糠秕孢子菌在37℃下在布鲁氏肉汤(Difco)中培养3-4天，其中加入抗生素(Skirrow’s补充物)和少量无菌油。
实施例2抗原的生产冻干卵圆形糠秕孢子菌从KCTC(Korean Collection for Type Cultures)购得用于制备抗原。将卵圆形糠秕孢子菌在布鲁氏肉汤培养基(Difco)中培养，其中补充抗生素(Skirrow’s补充物)和少量无菌油。将培养的细胞在3000×g下离心分离，然后在磷酸盐缓冲盐水溶液中再悬浮。在超声波破碎细胞之后，在10,000×g下离心15分钟除去没破碎的细胞。然后，将上清液取出，在100,000×g下超离心沉淀30分钟。将沉淀的细胞在蒸馏水中再悬浮，并用作下面试验的抗原。
实施例3细胞壁组分的纯化在获得根据实施例1在布鲁氏肉汤培养基中培养的细胞之后，将细胞在普通盐水溶液中清洗三到五次，然后在盐水溶液中悬浮。将细胞用超声波完全破碎。然后，将细胞液采用多孔纤维素或尼龙网过滤以分离细胞壁的不溶性组分，或采用实施例2中的离心方法沉淀。滤液或沉淀物用作下面试验的抗原。
实施例4制备含有抗体的卵黄已经开始产卵的21周龄的母鸡(Hy-Line Brown)用于抗体的生产。将在实施例2和3中获得的抗原与弗氏完全佐剂(Sigma chemical Co.)以相同数量混合，然后乳化。将1ml乳化抗原肌内注入母鸡腿中，然后在六周内再注射3次。收集免疫的卵用于测试免疫效价和与抗原的结合亲合力。
实施例5IgY结合活性的测试为确定生产的卵黄抗体的效应，使用ELISA方法。由如下方法纯化要使用的卵黄抗体(IgY)。
将5ml卵黄液体与5ml蒸馏水混合和加入20ml的0.15％λ红藻胶(Carageenan)，在室温下放置30分钟。然后，将溶液在20℃，3,000×g下离心15分钟，取出上清液。向上清液中加入15％硫酸钠(约3g)，搅拌，在室温下放置40分钟，在10,000×g下离心15分钟生产沉淀物。将沉淀物在磷酸盐缓冲溶液中再悬浮以获得抗体。
将1×109细胞/ml卵圆形糠秕孢子菌倒入五个10ml管中，将两种类型的抗体以12.5，25，50，和100mg/ml的数量加入到五个管的四个中。没有抗体的管用作对照物。将细胞摇动，在37℃下培养2小时。然后，将1ml培养物溶液取出，在60℃下加热30分钟，然后冷存。
抗体反应的结果由ELISA滴定方法测量并示于表1。
如表1所示，采用细胞壁组分生产的IgY具有更高的结合活性。证明用于降低细胞数目一半的抗体浓度是25mg/ml。
表1在各种IgY浓度下的卵圆形糠秕孢子菌细胞数目ELISA滴定方法按照如下步骤进行(1)采用包被缓冲剂稀释每组中的卵圆形糠秕孢子菌直到蛋白质浓度达到5μg/ml，每孔100μl溶液，在每个孔注入稀释的卵圆形糠秕孢子菌，并在4℃下保持48小时；(2)将100μl封闭缓冲剂加入到溶液中并在37℃下反应2小时；(3)采用洗涤溶液清洗3次；(4)采用封闭缓冲剂稀释从卵黄精制的IgY到100μg/ml，每孔注入100μl，在4℃下保持过夜或在37℃下孵化2小时；(5)采用洗涤溶液清洗5次；(6)采用封闭缓冲剂以1∶1000的比例稀释山羊抗-小鸡IgY-AP结合物，每孔注入100μl，在37℃下孵化2小时；(7)每孔加入100μl的底物，并在暗室中在30℃下反应；(8)采用洗涤溶液清洗6次；(9)加入100μl终止液；和(10)由ELISA读出器(450nm)读出。
实施例6纯化从卵黄生产的IgY收集含有抗卵圆形糠秕孢子菌的抗体的免疫卵。从卵中分离5ml的卵黄与5ml蒸馏水和20ml的0.15％λ红藻胶(Carageenan)混合，在室温下放置三十分钟。在20℃下，3,000×g离心十五分钟之后，取出上清液。将硫酸钠加入到上清液中达到19％的最终浓度，然后在室温下放置四分钟。然后，将溶液在10,000×g下离心十五分钟获得沉淀物，将溶液采用磷酸盐缓冲溶液增溶以生产抗体。采用BCA蛋白质测试试剂盒(Pierce)测量总的蛋白质浓度。将在280nm下测量的吸光度除以IgY的吸收系数1.33，用小鸡IgY的标准曲线(Promega)校正，而获得IgY浓度。
实施例7纯化的卵黄防头皮屑效果的测试由皮肤盘扩散方法(Skin Disc Diffusion Method)测试防头皮屑效果。首先，将卵圆形糠秕孢子菌接种到琼脂平板中，然后在37℃，需氧条件下培养两天。将圆形纸片(disc paper)采用70％乙醇消毒，用酮康唑、巯氧吡啶锌、甘宝素、水杨酸和防头皮屑IgY在不同浓度下处理，并放置在琼脂平板上。在37℃下孵化48小时之后，测量3次抑制区的尺寸，平均尺寸见表2，其中抑制区为包括纸片尺寸(1.2cm)的无菌区域。
根据表2，抗卵圆形糠秕孢子菌抗体的无菌区域的直径大于已知化合物。然而，与已知化合物相比，给出的IgY的摩尔浓度和扩散速率较低，IgY可能更为有效。
表2皮肤盘扩散方法的结果(n＝3)实施例8-11包括卵黄抗体的防头皮屑香波制造包含抗卵圆形糠秕孢子菌抗体的香波，并测试防头皮屑效果。
将pytoctoneamine、巯氧吡啶锌或IgY溶于蒸馏水，按表3所示的数量加入十二烷基硫酸钠，聚氧乙烯十二烷基醚硫酸钠(SodiumPolyoxyethylenelauryl ether sulfate)，二乙醇十二烷基酰胺(diethanollaurylamide)和丙二醇，加热到60℃。然后，将溶液冷却到40℃，与颜料，对苯甲酸酯，香料和柠檬酸混合，冷却到室温以生产香波。
*注卵黄抗体为根据实施例6通过纯化而生产的。
表3香波配方(单位重量百分比)对比例1-3包含卵黄抗体的防头皮屑香波为比较使用抗卵圆形糠秕孢子菌的卵黄抗体的防头皮屑香波的效果，包含已知化合物的香波组合物见表3。
试验1防头皮屑效果的临床测试由实施例8-11和对比例1-3的方法制备的香波的防头皮屑和瘙痒效果测试如下。
将香波用于到四十九名有头皮屑问题一个月的男性和女性志愿者。在志愿者采用通常使用的香波产品洗头之后，将在三天内积累的头皮屑收集并称重。相同的志愿者采用表2所示的香波产品每隔一天洗头一次持续1个月，将在三天内积累的头皮屑收集并称重。由真空吸入设备从头皮收集积累的头皮屑。
头皮屑的降低率计算如下。
头皮屑降低率(％)＝(在试验之前的头皮屑重量(mg)-在1个月之后的头皮屑重量(mg))/在试验之前的头皮屑重量(mg)×100测试结果见表4。
表4试验2防头皮屑效果的微生物学试验将表3中的香波材料加入到分别含有5.00、1.00、0.50、0.10、0.05、0.01和0.005％(wt)玉米油的Ym肉汤中以生产培养介质。将105-106CFU(菌落形成单元)/ml的卵圆形糠秕孢子菌在培养介质中接种并培养两天。从培养物获得最小抑制浓度(MIC)。测试结果见表5。
表5如从以上实施例所示，本发明提供包括抗卵圆形糠秕孢子菌抗体的防头皮屑组合物，该抗体通过采用作为抗原的卵圆形糠秕孢子菌使产卵母鸡产生免疫而生产，具有抑制卵圆形糠秕孢子菌增殖的活性。
权利要求
1.一种抗卵圆形糠秕孢子菌的抗体，通过采用卵圆形糠秕孢子菌作为抗原使动物产生免疫，然后从动物的干燥的血液或卵黄分离抗体而生产该抗体。
2.根据权利要求1的抗体，其中动物是兔子或产卵的母鸡。
3.根据权利要求1的抗体，其中抗原是卵圆形糠秕孢子菌的粗提取物或细胞壁组分。
4.根据权利要求1的抗体，其中抗原是37kD蛋白质或67kD蛋白质，该蛋白质对卵圆形糠秕孢子菌是特异的，存在于卵圆形糠秕孢子菌细胞壁的表面上。
5.一种预防头皮屑的组合物，包括作为有效剂的权利要求1～4任意一项的抗卵圆形糠秕孢子菌的抗体。
6.一种治疗脂溢性皮炎的组合物，包括作为有效剂的权利要求1～4任意一项的抗卵圆形糠秕孢子菌的抗体。
全文摘要
本发明涉及一种卵圆形糠秕孢子菌的抗体和它的用途。更具体地，本发明提供对卵圆形糠秕孢子菌的抗卵圆形糠秕孢子菌IgY，以及制备抗卵圆形糠秕孢子菌IgY的方法是通过超声波破碎卵圆形糠秕孢子菌以生产抗原，用该抗原使产卵母鸡免疫以生产IgY，并分离IgY。本发明还提供抑制头皮屑和改善脂溢性皮炎的组合物。
文档编号A61K39/395GK1524091SQ02808231
公开日2004年8月25日 申请日期2002年4月15日 优先权日2001年4月14日
发明者李钟和, 司空贞, 张东逸, 俞昶善, 张基浩, 全真姬 申请人:高台株式会社, 李&曺生物技术株式会社