专利名称：中国被毛孢无性繁殖方法
技术领域：
本发明涉及--种无性繁殖方法，特别涉及一种中国被毛孢无性繁殖方法。所述的中国被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu,Guo,YuetZeng)异名为冬 虫夏草真菌头孢子菌属菌种。
背景技术：
自然界生长的冬虫夏草的生长过程，实际上是蝙蝠蛾幼虫在进 食过程中被作为真菌的被毛孢感染，被毛孢利用蝙蝠蛾幼虫作营养基生长，直 至幼虫体内蛋白质被消耗殆尽，在幼虫的头部形成菌体的集合，称为子座，顶 端产生孢子，成熟后再崩发，再感染，周而复始，完成被毛孢有性繁殖的全部 过程。严格意义上，冬虫夏草既不是虫也不是草，是昆虫幼虫与真菌被毛孢的 结合体。完全模仿自然界冬虫夏草的有性繁殖规律来培养被毛孢，目前在技术上还 有相当大的困难，并受生产成本的制约。目前生产领域只有发酵的菌丝体作为 冬虫夏草替代品。而发酵的菌丝体无论在生长形态、细胞组织、活性组分含量 还是药用价值方面与天然冬虫夏草都有很大的差别。发明内容本发明的目的在于克服上述已有技术的不足，而提供一种中国 被毛孢无性繁殖方法，所要解决的技术问题是第一、利用真菌被毛孢单孢分 裂繁殖规律，采用无性繁殖方法培养获取作为天然冬虫夏草替代品的被毛孢有 性特征的菌体组织。第二、通过将昆虫蛋白、动物蛋白、海洋生物蛋白和植物 蛋白按照特定比例组合在一起，并通过独特的加工方法，制备出适合被毛孢快 速生长的优质低成本多元培养基。第三、提供一种菌种培养专用透气瓶盖，不
仅能够实现养殖瓶内自由水以水汽形式有序排出，而且有效防止霉菌侵入。 为了解决上述技术问题，本发明采用了以下技术方案一种中国被毛孢无性繁殖方法，其特征在于在蒸汽灭菌后的玻璃瓶内用手 术刀将菌体组织切碎；接种在玻璃瓶内的培养基表面；在玻璃瓶口盖上透气瓶 盖；将盖有透气瓶盖的玻璃瓶放置在养殖区，直至成熟；其中，培养基及手术刀具的灭菌温度110 12rC，灭菌时间25 30分钟； 养殖区空气净化度30万级，室内温度10 18。C，室内湿度RH 40% 550/0;其中，所述的培养基为每100kg培养基中含有蚕蛹7 9kg，去壳去皮扇 贝肉3 5kg，新鲜牛肉1.5 2.5kg，新鲜牛骨4 6kg，花生米0.4 0.6kg，鲜 牛奶4 6kg，大豆蛋白胨0.8 1.2kg，琼脂1.0 1.4kg，磷酸二氢钾40 60g， 硫酸镁15 25g，余量为水。环境湿度的控制是本发明的一项关键技术，湿度高于朋55%容易滋生霉菌， 低于RH40。/。则导致培养基水分过度挥发。本发明无性繁殖方法所培养的被毛孢，与自然条件生长的冬虫夏草以及发 酵法制得菌体相比较(1)、肉眼观察干品比对用发酵技术获得的菌体是灰白 色状态组织，比重较轻。用本发明方法获得的菌体为圆形，坚硬，表面凸起不 平，黄棕色，比重较大，与天然虫草子座的组织细胞形态基本相同。(2)、经中 国中医研究院中药研究所检验，有效成分含量本发明菌体〉天然虫草〉发酵菌丝。经中国科学院微生物研究所检测，本发明中国被毛孢菌体组织性状稳定，具备有性繁殖特征。(3)、转种观察将生长到4 5个月左右的被毛孢菌体连瓶倒置于装有培养基的玻璃瓶上，瓶口与瓶口连接处作无菌处理连接封闭。一个月后，五倍放大镜观察，培养基表面分布极少圆点白色的细胞组织，2 3个 月培养基表面布满白色半透明①2 3mm圆形，中间凹陷并伴生短绒毛状、有
立肉芽状态细胞组织，随后生长速度加快。有极少部分会生出1 2枝与天然虫草子座形态相同假性子座，但长势较弱，高约20 30mm，粗约^2mra，生长时间 短，极易倒状，倒状后与菌体组织生长在一起，无痕迹，取后晒干后极脆，长 至12 13个月后，由白色、半透明状变成黄色、浅棕色，成熟。与无性繁殖的 菌体形态无明显差别。观察表明，无性繁殖被毛孢仍具有性繁殖记忆特征。本发明的培养基及其制备方法的积极效果在于(1)、多年实践证明，本发 明的培养基能够满足被毛孢细胞快速分裂生长所需的必要氨基酸和其他营养元 素。每100ml培养基可可生产5g被毛孢菌体。(2)、采用本发明培养基的制备 方法，保证了制得培养基为可被直接吸收的小分子溶液，縮短了酶分解时间， 提高了被毛孢生长速度。(3)、培养基的生产周期短，制造成本低，经济性好， 适合产业化大面积推广利用。其中，作为海洋生物蛋白的扇贝肉作用尤其突出，如果采用其他蛋白代替， 将无法实现本发明的目的。另外，各种组分的配比也是本发明的关键，是经过 多年实验得到的数据。制备方法中的工艺步骤，工艺条件也是本发明的关键技 术，也是经过多年探索积累寻找到的，如果有所变动，将直接影响培养基的使 用性能。牛骨的用量比例较常规高，这是多年研究、试验发现的，采用本比例 明显促进被毛孢组织细胞的分裂生长，这也是本发明的关键点。本发明的透气瓶盖的积极效果在于(1)、透气管设置在瓶盖侧面，并在 透气管外端通过副盖安装有滤纸，不仅可以保证了养殖瓶内自由水以水汽形式 有序排出，而且有效防止霉菌感染；另一方面，由于瓶盖顶部无障碍设计，养 殖瓶可以纵向多层摆放，有效利用了空间，节省了占地面积。(2)、在灭菌过程 中，上述透气管能迅速起到增压和减压作用，从而縮短灭菌时间。(3)、在填充 培养基，尤其在接种过程中，能縮短与外界空气的接触时间，减少霉菌感染机
会，操作方便。(4)、即使该透气瓶盖被污染，清洗后更换滤纸可重复使用，降 低了物耗，节约了生产成本。(5)、透气管设有足够长度，即使霉菌孢子透过滤纸也很难感染瓶内菌种。(6)、透气管腔纵截面积经过科学计算设计，使得自由水通过量被控制在合理的范围内，不会因为通过量过大造成培养基过多、过快脱水，或者因为通过量过小导致瓶内积水，影响菌种的正常生长。(7)、瓶盖封 闭段下沿预留有用于紧密配合插入瓶口内的探入段，避免了灭菌时产生的汽化 水从瓶口与瓶盖丝扣之间的缝隙流出产生霉菌滋生载体的问题。
图1是本发明透气瓶盖的结构示意图。图2是被毛孢表面生长状态图片。图3是被毛孢鲜活菌体尺度图片。图4是被毛孢鲜活菌体高度图片。图5是被毛孢正常生长状态图片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例进一步说明本发明。 一、中国被毛孢无性繁殖首先从天然冬虫夏草中分离出菌体组织，或者取利用本方法繁殖的菌体组 织。在灭菌后的玻璃瓶内用手术刀将菌体组织切碎，越细越好。将细碎的菌体 组织接种在玻璃瓶内的培养基表面，在玻璃瓶口盖上透气瓶盖；将盖有透气瓶 盖的玻璃瓶放置在养殖区，直至成熟。其中，培养基及手术刀具的灭菌温度110 12rC，灭菌时间25 30分钟。 培养基灭菌后自然冷却12小时以上，置放区温度18。C以下。养殖区空气净化度30万级，室内温度10 18。C，室内湿度RH 40% 55%;接种量为每瓶20mn^左右。接种瓶为50ml和100ml PDA培养基两种装
生长期分为三个阶段。第一阶段约为30天，五倍放大镜观察，在PDA培养基表面与菌种的接触面缝隙生成乳白色、半透明细胞组织，细胞组织表面伴 生有白色短绒毛，局部生长直立、分枝、肉芽状组织。第二阶段约为120天的快速生长期，细胞组织分裂造成挤压向上隆起，有 肉芽状组织分裂最快，隆起表面呈高低不平，细胞组织仍是白色、半透明，厚 度约10 15mm，个别增厚至25mm以上。显微镜观察，在顶部表面有囊壳小空腔， 腔内有产孢细胞形成。切片观察，细胞组织呈微黄色、半透明。有较浓药香味， 内部有小孔洞，洞壁有白色短绒毛，导管细胞周围孔洞排列。第三阶段为成熟采集期，菌体表面细胞组织由白色半透明逐渐变黄、黄棕 色，培养基剩余不多，并开裂、干缩，没有可利用价值。原菌种碎屑变成黑棕 色，木质化，无再生迹象，并与新生成的细胞组织在一起。采集后菌体有粘连 部分培养基，用0.2MPa压縮空气吹掉，集中干燥，真空包装，即成初级产品。图2显示成品被毛孢的组织形态。图3显示菌体与培养基的比例。图4显示菌体的实际高度。图5显示被毛孢的正常生长状态。二、培养基制备实例实例1按照制备100kg培养基，(1) 、将去壳去皮扇贝肉4kg用清水浸泡48小时，再换水6次以上脱盐， 最后磨制成浆，作A组分；(2) 、将花生米0.5kg用水浸泡10小时，然后磨浆制成B组分；(3) 、新鲜牛肉2kg磨浆制成C组分；(4) 、蚕蛹8kg磨浆、去皮制成D组分；(5) 、将A、 B、 C、 D组分混合，加水补充到80kg，煮开，文火熬制30分钟，沉淀、滤除渣子，制成E组分；(6) 、将新鲜牛骨5kg用高压锅煮开后熬制30分钟，沉淀、滤除渣子，制成F组分；(7) 、将E组分和F组分混匀，加入鲜牛奶5kg，大豆蛋白胨lkg，琼脂1.2kg， 磷酸二氢钾50g，硫酸镁20g，并加水补充到100kg， 一并熬开，装瓶，灭菌， 冷却备接种用，其中灭菌温度115。C，灭菌时间30分钟。实例2按照制备100kg培养基，(1) 、将去壳去皮扇贝肉3kg用清水浸泡36小时，再换水6次以上脱盐， 最后磨制成浆，作A组分；(2) 、将花生米0.6kg用水浸泡8小时，然后磨浆制成B组分；(3) 、新鲜牛肉1.5kg磨桨制成C组分；(4) 、蚕蛹9kg磨浆、去皮制成D组分；(5) 、将A、 B、 C、 D组分混合，加水补充到85kg,煮开，文火熬制20分 钟，沉淀、滤除渣子，制成E组分；(6) 、将新鲜牛骨4kg用高压锅煮开后熬制20分钟，沉淀、滤除渣子，制 成F组分；(7) 、将E组分和F组分混匀，加入鲜牛奶6kg，大豆蛋白胨0.8kg，琼脂 L4kg，磷酸二氢钾40g，硫酸镁15g，并加水补充到100kg， 一并熬开，装瓶， 火菌，冷却备接种用，其中灭菌温度11(TC，灭菌时间28分钟。实例3
按照制备100kg培养基，(1) 、将去壳去皮扇贝肉5kg用清水浸泡60小时，再换水6次以上脱盐，最后磨制成浆，作A组分；(2) 、将花生米0.4kg用水浸泡12小时，然后磨浆制成B组分；(3) 、新鲜牛肉2.5kg磨浆制成C组分；(4) 、蚕蛹7kg磨浆、去皮制成D组分；(5) 、将A、 B、 C、 D组分混合，加水补充到75kg，煮开，文火熬制40分 钟，沉淀、滤除渣子，制成E组分；(6) 、将新鲜牛骨6kg用高压锅煮开后熬制40分钟，沉淀、滤除渣子，制 成F组分(7) 、将E组分和F组分混匀，加入鲜牛奶4kg，大豆蛋白胨1.2kg，琼脂 l.Okg，磷酸二氢钾60g，硫酸镁25g，并加水补充到100kg， 一并熬开，装瓶， 灭菌，冷却备接种用，其中灭菌温度12rC，灭菌时间25分钟。所用的水要求是纯净水，所用各种原料必须保证新鲜，无变质迹象。另外， 活蛹优于抽丝后的死蛹，死蛹优于干蛹。所制备的培养基PH值在5.5 6.5之间。 夏季配制的营养液放置时间一般不能超过6小时。 三、透气瓶盖具体实施方式
如图1所示，本实施例包括内壁带有与瓶口配合的丝扣的连接段1，在连接 段1上端还有封闭段2，在封闭段2的侧面有一段透气管4，滤纸5通过副盖6 固定在所述透气管4的外口端。封闭段2下端探入到连接段1上端面内壁以下，该探入段3外径与所配套 养殖瓶瓶口内径尺寸相配合。使用时，该探入段3正好插入到瓶口内。
透气管4的管腔纵截面为圆形。直径为9毫米或者12毫米，对应于50ml 禾口 100ml PDA培养基两种装量。
透气管4的长度一般为16毫米。
权利要求
1、一种中国被毛孢无性繁殖方法，其特征在于在蒸汽灭菌后的玻璃瓶内用手术刀将菌体组织切碎；接种在玻璃瓶内的培养基表面；在玻璃瓶口盖上透气瓶盖；将盖有透气瓶盖的玻璃瓶放置在养殖区，直至成熟；其中，培养基及手术刀具的灭菌温度110～121℃，灭菌时间25～30分钟；养殖区空气净化度30万级，室内温度10～18℃，室内湿度RH 40％～55％；其中，所述的培养基为每100kg培养基中含有蚕蛹7～9kg，去壳去皮扇贝肉3～5kg，新鲜牛肉1.5～2.5kg，新鲜牛骨4～6kg，花生米0.4～0.6kg，鲜牛奶4～6kg，大豆蛋白胨0.8～1.2kg，琼脂1.0～1.4kg，磷酸二氢钾40～60g，硫酸镁15～25g，余量为水。
2、如权利要求l所述的中国被毛孢无性繁殖方法，其特征在于所述的培养基的制备方法为按照制备100kg培养基，(1) 、将去壳去皮扇贝肉用清水浸泡36 60小时，再换水6次以上脱盐， 最后磨制成浆，作A组分；(2) 、将花生米用水浸泡8 12小时，然后磨浆制成B组分；(3) 、新鲜牛肉磨浆制成C组分；(4) 、蚕蛹磨浆、去皮制成D组分；(5) 、将A、 B、 C、 D组分混合，加水补充到75 85kg，煮开，文火熬制 20 40分钟，沉淀、滤除渣子，制成E组分；(6) 、将新鲜牛骨用高压锅煮开后熬制20 40分钟，沉淀、滤除渣子，制 成F组分；(7) 、将E组分和F组分混匀，加入鲜牛奶，大豆蛋白胨，琼脂，磷酸二氢钾，硫酸镁，并加入剩余的水， 一并熬开，装瓶，灭菌，冷却备接种用，其中灭菌温度110 121°C，灭菌时间25 30分钟。
3、 如权利要求1或2所述的中国被毛孢无性繁殖方法，其特征在于所述 透气瓶盖包括内壁带有与瓶口配合的丝扣的连接段(1)，在连接段(1)上端还 有封闭段(2)，在封闭段(2)的侧面有一段透气管(4)，滤纸(5)通过副盖(6)固定在所述透气管(4)的外口端。
4、 如权利要求3所述的中国被毛孢无性繁殖方法，其特征在于封闭段(2) 下端探入到连接段(1)上端面内壁以下，该探入段(3)外径与所配套养殖瓶 瓶口内径尺寸相配合。
5、 如权利要求3所述的中国被毛孢无性繁殖方法，其特征在于透气管(4) 的管腔纵截面为圆形，直径为9毫米或者12毫米；透气管(4)的长度为14—18 毫米。
全文摘要
本发明是一种中国被毛孢无性繁殖方法，其特征在于在蒸汽灭菌后的玻璃瓶内用手术刀将菌体组织切碎；接种在玻璃瓶内的培养基表面；在玻璃瓶口盖上透气瓶盖；将盖有透气瓶盖的玻璃瓶放置在养殖区，直至成熟。利用真菌被毛孢单孢分裂繁殖规律，采用无性繁殖方法成功培养获取了作为天然冬虫夏草替代品的被毛孢有性特征的优质菌体组织。
文档编号C12N1/14GK101126069SQ20071001681
公开日2008年2月20日 申请日期2007年7月5日 优先权日2007年7月5日
发明者姜善清 申请人:姜善清