专利名称：一种刺糖多孢菌菌株、其用途及制备多杀霉素的方法
技术领域：
本发明涉及一种刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)菌株、其用途及制备多杀霉素的方法。
背景技术：
多杀霉素(Spinosad)是一种具有触杀及摄食毒性的新型微生物源杀虫剂，具有对害虫广谱高效、对人、非靶标动物和环境极为安全、可生物降解的优异特点。多杀霉素具有全新的作用机理，它并不作用于乙酰胆碱酯酶和Na+通道，不同于传统的有机磷和拟除虫菊酯类杀虫剂。实验证明它对昆虫存在快速触杀和摄食毒性。它的作用方式是通过刺激昆虫的神经系统，导致非功能性的肌收缩、衰竭，并伴随颤抖和麻痹。这种作用结果和烟碱型乙酰胆碱受体被激活的结果是相一致的，显而易见这一作用机制在已知的害虫防治产品中是新颖和独特的。多杀霉素同时也作用于Y-氨基丁酸受体，有可能这进一步促成了其杀虫活性的提高，如此的作用模式可谓独一无二。吡虫啉和其他的烟碱性受体类的杀虫剂与多杀霉素的作用位点是不相同的。阿维菌素尽管也是一个天然产物，且同为大环内酯类，但其作用位点亦和多杀霉素不尽相同。迄今为止，尚未发现某类产品能以相同的作用方式影响昆虫的神经系统，而且尚无有关多杀霉素交叉抗性的报道。多杀霉素属广谱杀虫剂，能有效地控制鳞翅目、双翅目和缨翅目害虫，可以很好地防治鞘翅目和直翅目中某些大量吞食叶片的害虫种类。多杀霉素对鳞翅目幼虫的活性大大地高于各种有机磷、氨基甲酸酯杀虫剂，与拟除虫菊酯相当。多杀霉素具有高杀虫活性的同时，对捕食性昆虫还表现出较低毒性，对鳞翅目昆虫而言，多杀霉素是已发现的杀虫剂中选择性最高的化合物之一。此外，多杀霉素对蓟马、虱、白蚁以及许多膜翅目害虫也有较好的效果。根据中国农药毒性分级标准，多杀霉素属低毒杀虫剂。它对哺乳动物和鸟类相对低毒，对水生动物也只是轻微的中等毒性。因此，它是进行害虫综合治理的首选。然而，我国的多杀霉素发酵技术还不成熟，其根本原因在于菌种性能差，发酵液中多杀霉素的浓度只能达到2g/L，不具备工业应用价值。因而，需要生产多杀霉素能力强的菌种。
发明内容
本发明的一个目的是提供可产多杀霉素的菌株。本发明的另一个目的是提供由上述菌株制备多杀霉素的方法。本发明所提供的菌株为刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)Z68，其保藏编号为 CGMCC No. 3460。本发明还涉及由上述刺糖多孢菌菌株得到的突变株。本发明的另一方面还涉及上述刺糖多孢菌菌株或其突变株在生产多杀霉素中的用途。本发明还涉及制备多杀霉素的方法，包括以下步骤
(a)发酵本发明的刺糖多孢菌菌株、或其突变株，得到含有多杀霉素的发酵液；(b)从发酵液中分离多杀霉素。本发明的菌株产多杀霉素能力强，具备很好的工业应用价值。
图1为刺糖多孢菌种子培养成熟的显微照片。图2为发酵罐中本发明菌株的发酵曲线。图3为实施例1摇瓶发酵发酵液的HPLC分析图谱(保留时间3. 47分钟的峰为多杀霉素A组份，保留时间4. 33分钟的峰为多杀霉素B组份)。图4为多杀霉素标准品的HPLC分析图谱(A组份保留时间3. 53分钟，D组份的保留时间为4. 42分钟)。本发明菌株的保藏信息一种刺糖多孢菌菌株，拉丁学名Saccharopolyspora spinosa，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏日期2009年11月25日，保藏编号CGMCC No. 3460。
具体实施例方式本发明的一个目的是提供一种可产多杀霉素的菌株。本发明所提供的菌株为刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)Z68，其保藏编号为CGMCC No. 3460(以下简称刺糖多孢菌3460)。优选地，本发明的刺糖多孢菌3460的生产多杀霉素的能力达8g/L以上，9g/L以上，优选10g/L以上，更优选12g/L以上，例如8 15g/L，9 15g/L。本发明还涉及由上述刺糖多孢菌3460得到的突变株。优选地，突变株产多杀霉素的能力达8g/L以上，9g/L以上，优选10g/L以上，更优选12g/L以上，例如8 15g/L，9 15g/L。本发明的另一方面还涉及刺糖多孢菌3460或其突变株在生产多杀霉素中的用途。本发明的另一个目的是提供由上述菌株制备多杀霉素的方法。本发明所提供的制备多杀霉素的方法，包括如下步骤发酵刺糖多孢菌3460，得到含有多杀霉素的发酵液。在一种优选的实施方式中，本发明制备多杀霉素的方法包括以下步骤(a)发酵本发明的刺糖多孢菌3460、或其突变株，得到含有多杀霉素的发酵液；(b)从发酵液中分离多杀霉素。优选地，本发明的方法包括以下步骤在发酵之前，进行种子培养，得到种子培养液。在一种优选的实施方式中，分离多杀霉素通过以下进行(a)含有多杀霉素的发酵液与有机溶剂混合；(b)固液分离，得到多杀霉素提取液。这种将含有多杀霉素的发酵液与有机溶剂直接混合进行提取的方法，本文中简称为“液相提取法”。优选有机溶剂为极性有机溶剂。有机溶剂的实例为甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、二甲苯中的一种或至少两种的混合物，优选甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙酸乙酯以及乙酸丁酯中的一种或至少两种的混合物，更优选甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙酸乙酯，进一步优选甲醇、乙醇、丙醇以及乙酸乙酯中的一种或至少两种的混合物，最优选甲醇和乙醇中的一种或其混合物。在另一种优选的实施方式中，分离多杀霉素通过以下进行(a)发酵液固液分离，得到固体状态的含多杀霉素的菌丝体(b)将菌丝体中的多杀霉素溶解到有机溶剂中，固液分离，得到的液体即为多杀霉素提取液。这种将固体状态的含多杀霉素的菌丝体与有机溶剂混合进行提取的方法，本文中简称为“固相提取法”。步骤(b)中的有机溶剂可以为甲醇、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、 甲苯、二甲苯中的一种或至少两种的混合物。优选地，在将菌丝体中的多杀霉素溶解到有机溶剂中之前，对菌丝体进行干燥。优选地，发酵的温度为25 32°C，优选沈 30°C，更优选27 ，例如。优选地，发酵的时间为3 20天，优选5 15天，更优选7 10天。优选地，发酵在有氧发酵条件下，在培养基中进行。优选地，培养基含有可同化的碳源、氮源和水溶性无机盐。发酵中使用的发酵培养基可以是常规多种培养基中的任意一种。优选地，碳源为可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、糊精、玉米粉、油酸甲酯以及油类 (如豆油)中的一种或多种。优选地，氮源为棉子粉、豆饼粉、豆粕粉，玉米蛋白粉、玉米浸出物、酵母粉、酵母浸提物、鱼粉以及各类肉浸提物中的一种或多种。优选地，可加入培养基中的营养无机盐是能够产生下列离子中的一种或多种的水溶性无机盐锌离子、钠离子、镁离子、钙离子、铵离子、氯离子、碳酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子等。优选地，发酵为发酵罐发酵，通入发酵罐的空气流量为发酵液体积与每分钟通入发酵罐内的折成标准状态的空气体积之比为0. 3 2. 0，优选0. 5 2. 0，更优选0. 5 1. 5， 最优选0. 7 1. 5。在一种优选的实施方式中，包括如下步骤将刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)Z68CGMCC No. 3460或其突变株接种于种子培养基，进行种子培养，得到种子培养液，再将种子培养液接入发酵培养基中。种子培养液在发酵培养基中的接种量为30mL/L 150mL/L，优选 50ml/L 150ml/L。优选的种子培养基的组成为葡萄糖的终浓度为10g/L，糊精的终浓度为20g/L，豆粕粉的终浓度为3g/L，玉米浆的终浓度为6g/L，
硫酸镁的终浓度为2g/L ；种子培养基的消前pH值为7. 2。优选的发酵培养基组成和配比如下可溶性淀粉的终浓度为60g/L，葡萄糖的终浓度为10g/L，豆粕粉的终浓度为30g/L，玉米浆的终浓度为10g/L，豆油的终浓度为5g/L，碳酸钙的终浓度为5g/L，发酵培养基的消前pH值为7. 0。在一种优选的实施方式中，提取多杀霉素的方法为将含有多杀霉素的发酵液与极性有机溶剂(如甲醇)以适当体积比搅拌混和，用本行业已知方法固液分离，得到的液体即为多杀霉素提取液。在一种优选的实施方式中，采取下述方法从发酵液中提取多杀霉素使用本行业已知方法(例如过滤)将含有多杀霉素的发酵液固液分离，弃去液体，得到固体状态的含多杀霉素菌丝体。将上述菌丝内加入有机溶剂，将贮存于菌丝体中的多杀霉素溶解到有机溶剂中，使用本行业已知方法固液分离(例如过滤)，得到的液体即为多杀霉素提取液。实验证明，本发明的菌株生产多杀霉素的能力强，可达每升发酵液中含多杀霉素 9-15克。用本发明菌株来发酵制备多杀霉素，能够提高多杀霉素的生产效率，降低生产成本。实施例下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。菌株的分离及鉴定一、菌株的分离从中国南海采集海泥样品。将冷冻保藏的海泥样品梯度稀释，每个稀释度涂布2-3 块双碟培养基二8°C培养2-6周，培养时将双碟放置在湿润的纱布上面，保持一定的湿度， 防止双碟干燥；之后，每2-3天用相差显微镜观察一次双碟生长情况，将长出的微生物菌落转接至新双碟(如发现微小菌落不再生长及时将菌落挑入液体10%海水LB培养基静止培养2周左右时间，待液体内长出菌丝后，该菌已经复苏再进行双碟划线)，划线，进行形态观察，菌纯化后进行保藏入新菌种库。从菌种库中进行活性筛选，得到本发明具有活性的刺糖多孢菌菌株。与其它微生物相同，本发明的具有高产多杀霉素的菌株仍然易发生变异，因此，可以利用本领域已知的物理和化学方法得到这些菌株的突变株，例如，可以通过紫外线处理得到另一些菌株。二、菌株的鉴定通过PCR扩增该菌的16SrDNA，测序后发现，该菌与刺糖多孢菌的16S序列相同，鉴定为刺糖多孢菌。菌的形态刺糖多孢菌是好氧型革兰氏阳性放线菌，在大多数培养基(如YMS、ATCC174、苹果酸钙等)上都能生长良好，形成气生菌丝体。气生菌丝为粉黄色，营养菌丝为黄色到黄褐色，产浅粉黄色孢子或白色孢子。孢子链外观为珠状，有孢子壳，孢子壳表面为针状，这些针状物约1mm，环绕在末端上。孢子形状为椭圆形，平均大小约为1. IX 1.5 μ m。 孢子链长度超过50个孢子。菌体适宜的生长温度为25°C 35°C，在高渗条件下(11% NaCl)可以生长。菌丝的形态如图1所示。综上鉴定结果，本发明菌株为刺糖多孢菌 (Saccharopolyspora spinosa),^ " ^^ Z68。该菌株已于2009年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)， 保藏号为CGMCCNo. 3460，分类命名为刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)。菌株的应用一、发酵菌株制备多杀霉素玉米淀粉购自河北赵县兴柏药业集团；酵母膏购自上海棱光酵母制品有限公司； 玉米浆购自河北康欣制药有限公司；可溶性淀粉购自北京现代东方精细化学品有限公司； 豆粕粉购自北京康明威培养基技术有限公司；豆油购自广东金龙鱼食用豆油。( 一 )活化菌种甘油管(3-5支)保藏于-80°C冰箱中，取用其中1支室温缓慢融化，待完全融化后，以无菌移液管涂布均勻斜面培养基中。置于，湿度为56%的培养间，避光静止培养10天。斜面培养基的组成玉米淀粉的终浓度为25g/L，玉米浆的终浓度为20g/L，酵母膏的终浓度为lg/L，琼脂粉的终浓度为18g/L ；斜面培养基的消前pH值为7. 0。( 二 )分离待斜面成熟后进行分离。以无菌铁铲刮取面积约1. Ocm2的菌丝与孢子混合体，置于5mL无菌水的玻璃试管中，试管中盛有玻璃珠10粒左右，塞好胶塞，振摇5min ；利用事先准备好的过滤器对悬浮液进行过滤，除去其中菌丝体及剩余培养基；将过滤后孢子悬浮液进行梯度稀释，稀释梯度依次为IO-1UO-2UO-3UO-4UO-5,将每个稀释梯度悬浮液取IOOyL 加入双碟，用无菌三角刮刀涂布固体双碟3块。置于^°C，湿度为56%的培养间中静止、避光培养8天。固体双碟的培养基组成与斜面培养基的组成相同。(三)挑菌待分离双碟生长成熟后，选取合适密度的双碟(30个左右菌落/双碟)进行菌种的挑选。利用接种环刮取孢子均勻涂布于准备好的斜面培养基中。将涂布好的斜面置于观°C，湿度为56 %的培养间中静止、避光培养8天。(四)保存培养成熟的斜面置于-4°C冰箱中保存备用。
(五)传代旧斜面菌种保存时间不宜过长，应及时转接新斜面，转接时同样以无菌接种环刮取菌落表面孢子，涂布于新鲜斜面培养基中，以同样方法培养、保藏。(六)种子培养液的制备在250mL容积的三角瓶中，装40mL种子培养基，用2层纱布中间夹8g精梳棉作瓶塞，每瓶接已活化好的菌苔(含孢子、气生菌丝和基生菌丝)约Icm2，然后放置于恒温 (28°C)恒湿(56%)培养间中，以220rpm的转速进行培养，培养3天即成熟，得到种子培养液。种子培养基的组成葡萄糖的终浓度为10g/L，糊精的终浓度为20g/L，豆粕粉的终浓度为3g/L，玉米浆的终浓度为6g/L，硫酸镁的终浓度为2g/L ；种子培养基的消前pH值为7. 2。实施例1(1)摇瓶发酵向250mL容积的三角瓶中，装40mL发酵培养基，灭菌后备用。向瓶中接入4毫升种子培养液，进行摇床发酵培养，温度为，摇床转速为220rpm，培养8天，发酵环境的相对湿度56 %，得到约35mL发酵液。发酵培养基的组成可溶性淀粉的终浓度为60g/L，葡萄糖的终浓度为10g/L，豆粕粉的终浓度为30g/L，玉米浆的终浓度为10g/L，豆油的终浓度为5g/L，碳酸钙的终浓度为5g/L，发酵培养基的消前pH值为7.0。制作刺糖多胞菌生长曲线。刺糖多胞菌的生长曲线如图2所示。图2中，横坐标为发酵时间(小时)，纵坐标为多杀霉素的浓度(yg/mL)曲线表明该菌种可以稳定地生产多杀霉素长达270小时，最终发酵产量可以达到15000 μ g/mL以上。(2)提取多杀霉素液相提取法将发酵液与甲醇以体积比1 9混和振摇6小时；静置20分钟后，取上清溶液；用0. 4 μ m孔径的微孔滤膜过滤，获得发酵液甲醇提取液，待测。(3)产量检测按照“二、发酵液中多杀霉素的检测与分析”的方法进行检测。发酵滤液的高效液相色谱图如图3所示(样品被甲醇稀释至10倍，保留时间3. 47 分钟的峰为多杀霉素A组份，保留时间4. 33分钟的峰为多杀霉素B组份)，发酵滤液中多杀霉素的A组份保留时间为3. 47分钟；发酵滤液中多杀霉素的峰面积为2260。
样品测定液中多杀霉素的浓度为0.909g/L，换算得到平均每升发酵液中含有 9. 09克多杀霉素。实施例2(1)发酵采用上海国强FUS-50L全自动发酵罐系统进行发酵，培养基配比与实施例1相同， 控制工艺如下表1
控制参数控制点装量35L温度28"C ±0. 5"C转速起始400rpm，根据溶氧调解通气比1 1罐压0. 05MPa溶氧全程> 40%周期10天(2)提取多杀霉素固相提取法采取下述方法从发酵液中提取多杀霉素(固相提取法)取发酵液 ImL进行固液分离，弃去液体，得到固体状态的含多杀霉素菌丝体，将上述菌丝体干燥后，得到菌丝0. 4克，加入5mL甲醇振摇6小时；静置20分钟后，取上清溶液；用0. 4 μ m孔径的微孔滤膜过滤，获得发酵液甲醇提取液，待测。(3)产量检测产量检测方法与实施例1相同。发酵滤液中多杀霉素的A组份保留时间为3. 51分钟。样品测定液中多杀霉素的浓度为2. 5g/L，换算得到平均每升发酵液中含有12. 5 克多杀霉素。实施例3(1)发酵使用上海国强FUS-50L全自动发酵罐进行发酵，培养基配比除将实施例1培养基中的可溶性淀粉更改为玉米淀粉外，其它与实施例1相同，控制工艺与实施例2相同。(2)提取采用液相提取法，与实施例1相同。(3)产量检测发酵滤液中多杀霉素的A组份保留时间为3. 61分钟；发酵滤液中多杀霉素的峰面积为2908。样品测定液中多杀霉素的浓度为1. 17g/L，换算得到平均每升发酵液中含有 11. 7克多杀霉素。比较例1采用公司现有的国内通用低产菌株L318进行摇瓶发酵，发酵条件和提取条件与实施例1相同。经检测其发酵产量为1. 85g/L。比较例2采用公司现有的国内通用低产菌株L318进行，发酵条件和提取条件与实施例2相同。经检测器发酵产量为2. 2g/L。比较例3采用公司现有的国内通用低产菌株L318，发酵条件和提取条件与实施例3相同。 经检测其发酵产量为1. 75g/L。二、发酵液中多杀霉素的检测与分析多杀霉素HPLC检测1.取上述发酵液甲醇提取液，进行色谱检测。2.色谱条件如下仪器为LC-9101型循环制备液相色谱仪；色谱柱为YMC 0DS-A4. 6X150(日本YMC公司)，柱长150_，孔径4. 6_，填充介质为0DS-3，孔径5 μ m ；柱温25 0C ；自动进样器进样，进样量2 μ L ；洗脱液(流动相)的组成由A液、B液和C液组成，A液Β液C液= 45 25 30(体积比)；A液为甲醇，B液为已腈，C液为0. (体积百分含量)三氟乙酸(TFA)的水溶液。流动相流速为lmL/min。检测器为紫外检测器，检测激发波长M6nm。多杀霉素标准品为 Spinosad mixture of Spinosyn A und D PES,购自 Sigma-Aldrich，产品目录号为 33706-50MG。3.结果在如上色谱条件下，多杀霉素标准品的色谱图如图4所示。多杀霉素标准品中A 组份保留时间3. 53分钟，D组份的保留时间为4. 42分钟，含600 μ g/mL多杀霉素的标准品的A组份峰面积为1491。表2实施例1发酵液的HPLC数据
权利要求
1.一种刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)菌株，保藏编号为 CGMCC No. 3460。
2.由根据权利要求1所述的刺糖多孢菌菌株得到的突变株。
3.根据权利要求2所述的突变株，其中，所述突变株产多杀霉素的能力达每升发酵液 8g/L以上，9g/L以上，优选10g/L以上，更优选12g/L以上，例如8 15g/L，9 15g/L。
4.根据权利要求1所述的刺糖多孢菌菌株、或根据权利要求2至3任一项所述的突变株在生产多杀霉素中的用途。
5.制备多杀霉素的方法，包括以下步骤(a)发酵根据权利要求1所述的刺糖多孢菌菌株、或根据权利要求2至3任一项所述的突变株，得到含有多杀霉素的发酵液；(b)从所述发酵液中分离多杀霉素。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述发酵在有氧发酵条件下，在培养基中进行。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述培养基含有可同化的碳源、氮源和水溶性无机盐。
8.根据权利要求5至7任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤在所述发酵之前，进行种子培养，得到种子培养液。
9.根据权利要求5至8任一项所述的方法，其中，分离多杀霉素通过萃取法进行。
10.根据权利要求11所述的方法，其中，分离多杀霉素通过以下方法1或方法2进行方法1 (a)所述含有多杀霉素的发酵液与极性有机溶剂混合；(b)固液分离，得到多杀霉素提取液；方法2:(a)发酵液固液分离，得到固体状态的含多杀霉素的菌丝体；(b)将所述菌丝体中的多杀霉素溶解到有机溶剂中，固液分离，得到多杀霉素提取液。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述极性有机溶剂和/或所述有机溶剂为乙醇、甲醇、丁醇、丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、和二甲苯中的一种或至少两种的混合物， 优选甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙酸乙酯以及乙酸丁酯中的一种或至少两种的混合物，更优选甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙酸乙酯，进一步优选甲醇、乙醇、丙醇以及乙酸乙酯中的一种或至少两种的混合物，最优选甲醇和乙醇中的一种或其混合物。
全文摘要
本发明涉及一种刺糖多孢菌菌株(Saccharopolyspora spinosa)、其用途及制备多杀霉素的方法。本发明所涉及的菌株保藏编号为CGMCC No.3460。本发明还涉及由上述菌株得到的突变株。本发明还涉及制备多杀霉素的方法，包括以下步骤a)发酵本发明的刺糖多孢菌菌株或其突变株，得到含有多杀霉素的发酵液；b)从发酵液中分离多杀霉素。本发明的菌株产多杀霉素能力强，具备很好的工业应用价值。
文档编号C07H1/06GK102337219SQ20111018724
公开日2012年2月1日 申请日期2011年7月5日 优先权日2010年7月19日
发明者蒋勤军 申请人:牡丹江佰佳信生物科技有限公司