专利名称：一种红色糖多孢菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵领域，具体地，涉及一种红色糖多孢菌及其在发酵生产红霉素中的应用。
背景技术：
红霉素为大环内酯类抗生素，具有与青霉素类似的抗菌谱，特别对革兰氏阳性细菌、抗酸杆菌、立克次氏体及大病毒有抗菌活性，是治疗耐药性金黄色葡萄球菌感染和溶血性链球菌感染所引起疾病的首选药物。其作用机制主要是与核糖核蛋白体的50S亚单位相结合，抑制肽酰基转移酶，影响核糖核蛋白体的移位过程，妨碍肽链增长，抑制细菌蛋白质的合成，从而起到抑菌作用。红色糖多孢菌在发酵过程中会产生A，B，C三个组分，其中A组·分活性最强，所占比例也最大，根据菌种特性的不同比例约在60 % 80%。B和C两个组分活性较差，且具有一定毒性，所占比例因菌种不同而已，比例在10%以内，一般为3% 5%。目前国内拥有红霉素原料药批文的企业近40家，其主要下游产品硫氰酸红霉素的生产厂家已近30家，2007年国内年产硫氰酸红霉素可达8000吨以上。红霉素衍生物阿奇霉素、琥乙红霉素、罗红霉素、克拉霉素等产量逐年增加，销售额不断上升，预计今后仍有广阔的发展空间。随着市场对红霉素衍生品的大量需求，红霉素原药需求量也将逐年增大。在激烈的市场竞争中，生产菌种本身质量是占据行业优势的决定性因素，因为高产菌种在不增加任何生产成本(原料、动能、人员等)的情况下即可大幅度提高产量。目前国外红霉素发酵水平明显高于国内，我国于1958年开始试制红霉素，1965年开始在上海第三制药厂正式投产，当时发酵单位不足3000 μ g/mL。后来经过多年的菌种选育及工艺优化，发酵单位逐渐提高，目前国内平均发酵单位可达8000 μ g/mL，但与目前国际上的18000 μ g/mL仍然有较大的差距，较低的发酵单位仍是限制我国红霉素发酵工业发展的重要因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红色糖多孢菌及其发酵生产红霉素的应用，以提高我国红霉素发酵行业的红霉素发酵效率。本发明提供的菌株BJX001，该菌株于2011年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No. 4767，分类命名为红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)。红色糖多孢菌菌株BJX001形成紧密螺旋形的孢子链，孢子呈球形或卵圆形，表面光滑。在蔗糖硝酸盐琼脂培养基中，气丝厚，白色至淡粉色，基丝微黄色，后变红色，无可溶色素；在营养琼脂培养基中，基丝乳脂色，无可溶色素。本发明提供了一种通过发酵红色糖多孢菌BJX001制备红霉素的方法，包含培养和发酵两个阶段
(I)将红色糖多孢菌BJXOOl接种于斜面菌种培养基中，置于35 37°C，55% 65%湿度的培养箱中静止培养144 192小时；(2)从培养成熟的斜面菌种培养基中挖取面积约Icm2大小的菌苔接种于发酵培养基中，在温度为30 34°C的条件下，振荡培养，相对湿度为50 % 60%，培养46 50小时后，向发酵培养基中一次性补加过滤除菌的正丙醇，使其质量百分比终浓度为1.0%，控制发酵时间在168 216小时内，得到红霉素。为了防止发酵液因过多蒸发而浓缩，造成发酵单位虚高，保持发酵过程中所述环境相对湿度为50 % 60%。上述振荡转速优选220r/min，发酵时间优选192小时。
本发明菌种培养基组份为玉米淀粉10 14g/L，玉米浆5 7g/L，七水硫酸镁
O.8 I. 2g/L，碳酸钙2. 5 3. 5g/L，琼脂粉20 24g/L，余量为水，灭菌前以氢氧化钠溶液调节pH至7. O 7. 4。本发明菌种培养基组分优选为玉米淀粉12g/L，玉米浆6g/L，七水硫酸镁O. I %lg/L，碳酸钙3g/L，琼脂22g/L，余量为水，灭菌前以氢氧化钠溶液调节pH至7. 2。本发明发酵培养基组份为玉米淀粉40_60g/L，黄豆饼粉16_24g/L，玉米浆(其中干物质含量为30% -60% ) 8-12g/L，酵母粉4-6g/L，磷酸二氢钾O. 4-0. 6g/L，氯化钠4_6g/L，豆油4-6g/L，碳酸钙4-6g/L，余量为水，灭菌前以氢氧化钠溶液调节pH至6. 5-7. 5。所述浓度均为在发酵培养基中的终浓度。本发明发酵培养基组份优选为玉米淀粉50g/L，黄豆饼粉20g/L，玉米浆10g/L，酵母粉5g/L，磷酸二氢钾O. 5g/L，氯化钠5g/L，豆油5g/L，碳酸钙5g/L，余量为水，灭菌前pH调节为7. O。本发明添加正丙醇的终浓度为10mL/L。本发明发酵液化学效价的测定方法是预估发酵液产量之后将其稀释至300-500 μ g/mL范围，加入碳酸钾与醋酸丁酯进行萃取，取有机相调酸，取水相进行温水浴，将水浴的后的溶液进行紫外分光光度计比色，得到的吸光度带入线性公式计算发酵效价。实验证明，本发明的菌株生产红霉素的能力强，其发酵液的化学效价可达10000 μ g/mL，而且本发明菌株连续传5代后其生产红霉素的能力仍保持原来水平，表明其遗传稳定性好。用本发明菌株来制备红霉素的方法，能够提高生产红霉素的效率，而且方法简单、成本低廉。因此，本发明菌株及制备红霉素的方法适合于在红霉素的生产中推广应用。
图I是红色糖多孢菌菌落形态图；图2是红色糖多孢菌种子成熟时显菌丝体形态图；图3是红色糖多孢菌发酵60小时菌丝形态图；图4是红霉素标准品高效液相色谱图，其中组分A保留时间为5. 257min,面积为3428639 ；B组分保留时间为3. 147min ；C组分保留时间为7. 889 ；图5是红霉素样品高效液相色谱图，其中组分A保留时间为5. 260min,面积为3380373. 2出组分保留时间为3. 115min，峰面积为311 ;(组分保留时间为7. 808，峰面积为83715. 8。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I菌株的分离及鉴定I、菌株的分离从黑龙江省宁安市随机采集泥土样品。将冷冻保藏的泥土样品梯度稀释，每个稀释度涂布2-3块双碟培养基，34°C培养2-6周，培养时将双碟放置在湿润的纱布上面，保持一定的湿度，防止双碟干燥；之后，每2-3天用相差显微镜观察一次双碟生长情况，将长出·的微生物菌落转接至新双碟(如发现微小菌落不再生长及时将菌落挑入液体10% LB培养基静止培养2周左右时间，待液体内长出菌丝后，该菌已经复苏再进行双碟划线)，划线，进行形态观察。2、菌株的鉴定红色糖多孢菌是好氧型革兰氏阳性放线菌，气生菌丝为粉黄色，营养菌丝为黄色到黄褐色，产灰色或灰白色孢子。孢子呈球形或卵圆形，表面光滑。在蔗糖硝酸盐琼脂培养基中，气丝厚，白色至淡粉色，基丝微黄色，后变红色，无可溶色素；在营养琼脂培养基中，基丝乳脂色，无可溶色素。菌体生长温度为25-38°C。本发明分离的菌株其生长特性和形态均符合红色糖多孢菌。菌落的形态如图I所示，种子菌丝形态如图2所示。通过PCR扩增该菌的16SrDNA，PCR所用的引物序列为正向引物CGACAGTCATTGTTGGAGAG反向引物TGCTCCTTAGAAAGGAGGTG。将PCR产物进行凝胶电泳，发现与目的条带大小相同，为1542bp。测序后发现，该菌与红色糖多孢菌的16S序列相同，鉴定为红色糖多孢菌。综上鉴定结果，本发明菌株为红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea),将该菌株命名为BJX001。菌纯化后进行保藏入新菌种库。从菌种库中进行活性筛选，得到本发明具有活性的红色糖多孢菌菌株。该菌株于2011年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo. 4767，分类命名为红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)。实施例2发酵生产红霉素菌种培养基的配备I、培养基配方玉米淀粉12g/L，玉米浆6g/L，七水硫酸镁lg/L，碳酸钙3g/L，琼脂22g/L，余量为水，灭菌前以氢氧化钠溶液调节pH至7. 2。2、配制方法先向IL烧杯中加入蒸馏水700mL，置于带有石棉网的电热板上加热，称取玉米淀粉12g以IOOmL水溶解，待蒸馏水加热至70-80°C左右时，将溶解的淀粉溶液缓缓注入蒸馏水中，并以玻璃棒匀速搅拌，以免淀粉因迅速受热而板结，待淀粉溶液澄清后，将烧杯浸入冷水中冷却。分别称取相应量玉米浆、七水硫酸镁加入50mL烧杯中，以30mL蒸馏水溶解后加入冷却的玉米淀粉液中，搅拌均匀。冷却至室温后定容至1L，以10%氢氧化钠溶液调pH至7. 2。向调解pH值后的培养基中加入相应量的碳酸钙及琼脂。充分搅拌均匀后分别装入IOOOmL的三角烧瓶中，每瓶500mL，依次用2层棉垫，牛皮纸，线绳包扎好后放入灭菌锅内，以O. IMPa, 121 °C的高压蒸汽灭菌锅灭菌30分钟，待培养基温度降到45°C 50°C时进入无菌室内的超净工作台上，按无菌操作向无菌双碟中倒入25 30mL的培养基，凝固后可做分离菌种使用。另外，还可以将上述培养基制成茄瓶固体斜面在每个茄瓶(250mL)内分装入 80mL培养基，再依次用棉塞、2层纱布、牛皮纸、线绳包扎好后放入灭菌锅内，以O. IMPa,121°C的高压蒸汽灭菌30min，待培养基温度降到45°C 50°C时，取出茄瓶，在操作台上摆成斜面，凝固后备用。发酵培养基的配备培养基配方玉米淀粉50g/L，黄豆饼粉20g/L，玉米浆10g/L，酵母粉5g/L，磷酸二氢钾O. 5g/L，氯化钠5g/L，豆油5g/L，碳酸钙5g/L，余量为水，灭菌前pH调节为7. O。配制方法将称好的玉米淀粉，按照配制固体培养基的方法液化到透明后，置于冷水中冷却至室温，分别将黄豆饼粉，酵母粉，玉米浆，磷酸二氢钾，氯化钠，豆油按相应量称取，加入小烧杯中，以少量水充分溶解后加入液化好的玉米淀粉中，搅拌均匀后调PH至
7.0，加入相应量的碳酸钙搅匀后，分装入250mL三角烧瓶中，每瓶装入量为35mL，然后依次用8层纱布垫，牛皮纸，线绳包扎好后放入灭菌锅内，以O. lMPa，121°C的高压蒸汽灭菌30min。取出放入无菌缓冲间中自然冷却，备用。发酵生产I)菌种活化将红色糖多孢菌BJX001菌种冻存管自_80°C菌库中取出后，自然解冻至室温。以无菌移液器吸取O. 5mL菌悬液加入准备好的斜面培养基中，以接种环涂布均匀，置于温度36°C，湿度50 %的培养箱中静止培养168小时左右。2)菌种分离。从成熟的活化菌种斜面中挖取Icm2左右的菌苔，放于带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，220r/min，震荡lOmin。将震荡后的孢子悬浮液进行10倍梯度稀释，之后将各稀释梯度的悬浮液进行涂布平板涂布，150 μ L/平板。将平板倒置于36°C，湿度50%的培养箱中静止培养。3)斜面培养。选择合适浓度的涂布平板(每平板20-30个菌落)，以无菌环挑取单菌落，接种于事先准备的茄瓶培养基中，以“之”字形线路涂布均匀，置于36°C，50%湿度的培养箱中静止培养168小时左右。4)摇瓶培养。从培养成熟的斜面菌种中挖取面积约Icm2大小的菌苔接种于事先准备好的发酵培养基中，置于220rpm的摇床上培养，培养温度32°C，湿度60%。培养至48小时，向摇瓶中一次性补加过滤除菌的正丙醇(纯度为50% )使终浓度达到10mL/L，之后继续培养192小时，放瓶检测产量。实施例3红霉素的提取及产量检测。I、化学法检测。I)试液及配制A. O. 35%碳酸钾称取35g碳酸钾溶于IOOOOmL水中，摇匀。B.醋酸丁酯透明清亮的工业丁酯。C. O. lmol/L盐酸90mL盐酸用水稀释至IOOOOmL,摇匀。D. 8mol/L硫酸450mL硫酸缓缓倒入550mL水中，搅匀，冷却后，标定。
2)标准曲线的绘制A.精密称取红霉素标准品适量，加少量乙醇溶解，用蒸馏水稀释至100mg/mL。B.准确量取lmL、2mL、3mL、4mL、5mL于试管中，分别用水稀释至5mL,再加8mol/L的硫酸5mL，摇匀，于50°C水浴中保温30分钟。C.冷却后，用721型分光光度计483nm处比色。D.以同样溶剂作空白，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标作标准曲线，求出线性方程，绘制标准曲线表，见表I。表I标准曲线表
权利要求
1.红色糖多抱菌(Saccharopolysporaerythraea) BJXOOI,其保藏号为 CGMCCNo.4767。
2.权利要求I所述的菌株在制备红霉素中的应用。
3.一种制备红霉素的方法，该方法用权利要求I所述菌株发酵生产红霉素。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 (1)将红色糖多孢菌BJXOOl接种于斜面菌种培养基中，置于35 371，55% 65%湿度的培养箱中静止培养144 192小时； (2)从培养成熟的斜面菌种培养基中挖取面积约Icm2大小的菌苔接种于发酵培养基中，在温度为30 34°C的条件下，振荡培养，相对湿度为50 % 60%，培养46 50小时后，向发酵培养基中一次性补加过滤除菌的正丙醇，使其质量百分比终浓度为1.0%，控制发酵时间在168 216小时内，得到红霉素。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的菌种培养基组份为玉米淀粉10 14g/L，玉米浆5 7g/L，七水硫酸镁O. 8 I. 2g/L，碳酸钙2. 5 3. 5g/L，琼脂粉20 24g/L，余量为水，pH 7. O 7. 4。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的菌种培养基组份为玉米淀粉12g/L，玉米浆6g/L，七水硫酸镁O. lg/L，碳酸钙3g/L，琼脂粉22g/L，余量为水，pH 7. 2。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基组份为玉米淀粉40 60g/L,黄豆饼粉16 24g/L,玉米衆8 12g/L,酵母粉4 6g/L,磷酸二氢钾O. 4 O. 6g/L,氯化钠4 6g/L,豆油4 6g/L,碳酸I丐4 6g/L,余量为水，pH 6. 5 7. 5。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基组份为玉米淀粉50g/L，黄豆饼粉20g/L，玉米浆10g/L，酵母粉5g/L，磷酸二氢钾O. 5g/L，氯化钠5g/L，豆油5g/L，碳酸钙5g/L，余量为水，pH 7. O0
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，添加正丙醇的终浓度为10mL/L。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其中步骤2)所述温度为32°C，所述振荡培养的转速为200 250r/min，旋转半径为50mm，发酵周期为192小时。
全文摘要
本发明提供了一种红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)新菌株BJX001，其保藏编号为CGMCC No.4767。本发明还提供了通过发酵红色糖多孢菌BJX001可以得到红霉素的应用。实验证明，本发明的菌株其发酵方法生产红霉素A组分的能力强，生产红霉素的化学效价可达10000μg/mL发酵液，且本发明菌株连续传5代后其生产红霉素有效组分A的能力保持原水平，表明其遗传稳定性好，能够提高生产红霉素的效率，而且方法简单、成本低廉，适合于在红霉素的生产中推广应用。
文档编号C12R1/645GK102911874SQ20111022433
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者徐兵, 周贤龙, 王伟, 汪爱群 申请人:牡丹江佰佳信生物科技有限公司