专利名称：甘蔗黑穗病菌dna快速提取方法
技术领域：
本发明属植物保护领域，具体是一种甘蔗黑穗病菌DNA的快速提取方法。
背景技术：
甘蔗黑穗病(Ustilago scitaminea Syd.)已成为世界各植蔗区的主要病害之一。 该病害在一些蔗区曾流行和引起重大的经济损失，至今仍在造成不同程度的经济损失。黑 穗病发生的轻重与甘蔗品种的抗病性和感病性有密切的关系，抗病性较强的品种发病率低 于10%，感病的品种发病率可高达50%以上，宿根蔗产量损失高达70%，严重的甚至高达 80-90%。甘蔗黑穗病是由黑粉菌引起的一种真菌性甘蔗病害，目前应用分离培养技术、血 清(ELISA)或PCR技术等多种方法检测该病害，其中PCR技术是广泛应用于该病害检测的 一种分子技术，能够准确快速地诊断该病害。但是应用PCR技术对病菌进行准确检测要求 有高质量的病菌DNA，因此建立一种快速高效的甘蔗黑穗病菌DNA的提取方法非常必要。
发明内容
本发明提供一种甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，以弥补上述不足，通过对提取 高质量的病菌DNA进行准确快速的PCR检测鉴定，能够及时掌握甘蔗生产中该病害的发生 情况，制定有效的防控措施，同时为今后开展甘蔗黑穗病抗性品种/材料筛选研究提供技 术支撑。本发明方法通过以下技术方案实现其发明目的直接取甘蔗黑穗病发病植株上 的病菌孢子，采用尿素提取混合液对病菌进行研磨，经过振荡混勻，离心取上清液，加入 等体积氯仿/异戊醇溶液，振荡混勻，离心取上清液，加入2倍体积异丙醇和1/10体积 NaAC，-20°C放置lh，离心弃上清液，用70%乙醇洗沉淀，室温干燥；溶于800 μ L双蒸水，加 入RnaseA 2 μ L，37°C水浴60min，加入等体积氯仿/异戊醇溶液，振荡混勻，离心取上清液， 加入2倍体积异丙醇和1/10体积NaAC，-20°C放置lh，离心弃上清液，用70%乙醇洗沉淀， 离心弃上清液，室温干燥，即可获得高质量的甘蔗黑穗病菌基因组DNA，将DNA溶于100 μ L 灭菌双蒸水中，经琼脂糖凝胶电泳检测，DNA条带完整、明亮。本发明的优点和积极效果是由于甘蔗黑穗病菌在固体培养基上分离培养生长缓慢，传统方法要先对病菌进行 分离培养，再对病菌进行DNA提取，需要的周期长，步骤繁琐。本方法直接取甘蔗黑穗病发 病植株上的病菌孢子进行DNA提取，取代了传统的对病菌进行分离培养后再进行DNA提取 的方法，大大缩短了周期，减少了繁琐的步骤。此外，本方法利用尿素混合液直接研磨病菌，取代了利用液氮研磨病菌后再用提 取液抽提的步骤，缩减了程序，节省了费用。综上所述，本方法具有操作简便、快速、经济、高 效等特点。
图1是本发明采用甘蔗黑穗病菌DNA凝胶电泳检测的DNA条带。
具体实施例方式从田间采集甘蔗黑穗病发病植株，直接取病株上的黑穗病菌孢子进行DNA提取。 步骤如下1、取0. 5g病菌孢子于研钵，加入600 μ L尿素提取混合液研磨，该尿素提取混合液 的组成为 7mol/L Urea、50mmol/L Tris-HCl pH 8. 0,62. 5mmol/L NaClU % SDS ；2、转移菌液于2mL离心管，加入800 μ L尿素提取混合液，于振荡仪上充分振荡混 勻，12000r/min 离心 5min ；3、取上清液于一新的2mL离心管，12000r/min离心5min ；4、将上清液移入另一新的2mL离心管，加入等体积氯仿/异戊醇(24 1)溶液， 用力振荡数次混勻，12000r/min离心5min ；5、取上清液到一新的2mL离心管，加入2倍体积异丙醇和1/10体积3mol/ LNaAc (pH 5. 2)，_20°C放置 lh, 12000r/min 离心 IOmin ；6、弃上清液，倒置使管壁液体流尽，70%乙醇洗沉淀2次，12000r/min离心5min， 弃上清液，室温放置干燥，沉淀溶于800 μ L双蒸水，加入RNaseA (10 μ g/ μ L) 2 μ L, 37°C水 浴60min ；获得了高质量的甘蔗黑穗病菌基因组DNA，如图1。
权利要求
甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，其特征是取甘蔗黑穗病发病植株上的黑穗病菌孢子0.5g，采用尿素提取混合液研磨病菌，振荡混匀，离心取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇溶液，振荡混匀，离心取上清液，加入2倍体积异丙醇和1/10体积NaAc， 20℃放置1h，离心弃上清液，用70％乙醇洗沉淀，室温干燥；溶于800μL双蒸水中，加入RNaseA 2μL，37℃水浴60min，加入等体积氯仿/异戊醇溶液，振荡混匀，离心取上清，加入2倍体积异丙醇和1/10体积NaAc， 20℃放置1h，离心弃上清液，用70％乙醇洗沉淀，离心弃上清液，室温干燥，即可获得甘蔗黑穗病菌DNA。
2.根据权利要求1所述的甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，其特征是从田间采集甘 蔗黑穗病发病植株，直接取病株上的黑穗病菌孢子进行DNA提取。
3.根据权利要求1所述的甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，其特征是所用尿素提取 混合液为 7mol/L Urea、50mmol/L Tris-HC 1 pH 8. 0,62. 5mmol/LNaClU % SDS0
4.根据权利要求1所述的甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，其特征是所述的氯仿 异戊醇按24 1配制。
5.根据权利要求1所述的甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，其特征是所述的NaAc按 3mol/L、pH 5. 2 配制。
6.根据权利要求1所述的甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，其特征是所述的RnaseA 按IOyg/μ L配制。
全文摘要
一种甘蔗黑穗病菌DNA快速提取方法，取甘蔗黑穗病发病植株上的黑穗病菌孢子0.5g，采用尿素提取混合液研磨病菌，振荡混匀，离心取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇溶液，振荡混匀，离心取上清液，加入2倍体积异丙醇和1/10体积NaAc，-20℃放置1h，离心弃上清液，用70％乙醇洗沉淀，室温干燥；溶于800μL双蒸水中，加入RNaseA 2μL，37℃水浴60min，加入等体积氯仿/异戊醇溶液，振荡混匀，离心取上清，加入2倍体积异丙醇和1/10体积NaAc，-20℃放置1h，离心弃上清液，用70％乙醇洗沉淀，离心弃上清液，室温干燥，即可获得甘蔗黑穗病菌DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，DNA条带完整，明亮。
文档编号C12N15/10GK101935644SQ20101025816
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者卢文洁, 李如丹, 李文凤, 王明强, 王晓燕, 罗志明, 黄应昆 申请人:云南省农业科学院甘蔗研究所