专利名称：从甘蔗的嫩叶中提取过氧化物酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种酶的制备技术，尤其涉及过氧化物酶的提取。过氧化物酶，英文简称POD，其催化的反应为，这类酶以铁啉为辅基，在生物界广泛存在，在细胞代谢大氧化还原过程中起重要的作用。
随着酶标技术的广泛应用，特别在医院中作为常规手段检测抗原、抗体而大使量用。作为标记酶，过氧化物酶是目前使用最普遍地一种酶。它的标记物既能用于定位检测，也能用于定量测定，因此分离制备过氧化物酶意义重大。
以往人们多从辣根中提取过氧化物酶，作为原料要专门种植辣根，辣根作为非种植植物，原料来源受到一定限制，需要专门大量的种植，成本投资大。而本发明的原料则是甘蔗生产中的废弃物——甘蔗嫩叶，原料来源广泛而廉价，可作为甘蔗生产中的副产品来提高农民的收入。另外，生产过程中的废水含有大量N、P、K可作为肥料还田。
本发明目的提供一种从甘蔗嫩叶中提取过氧化物酶的方法，更好地解决甘蔗生产过程中副产品的利用以及克服以辣根生产过氧化物酶的原料来源困难之不足。
本发明以甘蔗嫩叶为原料，原料清洁后，加入预冷4℃的0.05mol/LpH＝7.0磷酸钾抽提液匀浆抽提。原料与抽提液的比例为1∶2(重量与体积比)，匀浆后过滤，弃去滤渣，取滤液，于滤液中加入固体硫酸铵，边加边搅拌至饱和度达40％，置0-4℃下静置后以4000rpm离心。弃沉淀得清液，在清液中再加入固体硫酸铵，边加边搅拌至饱和度达80％，置0-4℃下静置后以4000rpm离心。弃清液，得沉淀物，沉淀物即为粗酶；于粗酶中加入4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸钾缓冲液，粗酶与缓冲液加入量的比例为1-2∶50(g/v)，装入透析袋中，放入重蒸馏水在4℃下透析直至硫酸铵透析完毕为止。透析后于4000rpm离心，弃沉淀，所得的上清液置于冰浴中，不断搅拌，慢慢加入1倍体积预冷至-15℃乙醇溶液，静置后4000rpm离心，弃去沉淀，于上清液再加入原上清液的1倍体积-15℃乙醇溶液，静置后4000rpm离心，收集沉淀，将沉淀溶于预冷4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸钾缓冲液中，在重蒸馏水中透析除去乙醇。可得到R2值近于1的酶溶液；将酶溶液经Sephadex G-100层析柱层析，用pH6.8 0.02mol/L磷酸钾缓冲液洗脱，自动部分收集器收集，恒流泵恒流，收集呈酶活性的洗脱液，将洗脱液在4℃下超滤，冻干，即为纯酶制剂。
本发明是这样实施的1、原料匀浆称取甘蔗嫩叶1000g，洗净、凉干。加入预冷4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸钾抽提液2000mL，匀浆，匀浆后用140目尼龙布过滤，弃去残渣，得滤液。2、酶的制备于上述滤液中慢慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌至饱和度达40％置0-4℃下放置过夜，次日在常温下，以4000rpm离心15min，弃沉淀，得上清液。在上清液中再加入固体硫酸铵，边加边搅拌至饱和度达80％，置0-4℃下放置过夜，以4000rpm离心20min，弃上清液，得沉淀，此沉淀即为粗酶。3、乙醇分级分离向16.3g粗酶中加入100mL预冷4℃的0.05mol/L pH7.0磷酸钾缓冲液，将溶液于透析袋中，放入重蒸馏水中于4℃下透析48小时。直至硫酸铵透析完毕为止(可用5％乙酸钡溶液检查)，透析在4℃下进行，将透析袋中液体倒出，4000rpm离心15min，弃沉淀，得上清液。将上清液倒入烧杯并置于冰浴中，在不断搅拌下慢慢加入1倍原上清液体积的-15℃乙醇溶液，放置20min，4000rpm离心20min，收集沉淀，将沉淀溶于20mL 0.05mol/L pH7.0磷酸钾缓冲液中，在重蒸馏水中透析除去乙醇，可得R2值近于1的酶溶液(R2值表明酶的纯度，R2＝O.D403nm/O.D275.nm)。4、葡聚糖凝胶G-100柱层析将上述酶液进行浓缩，将上述酶液经葡聚糖凝胶G-100层析柱层析，层析柱规格为2×40cm。用pH6.8 0.02mol/l磷酸钾缓冲液洗脱，自动部分收集器收集，恒流泵恒流，每管5mL，收集呈酶活性的洗脱液，将洗脱液在4℃下超滤，冻干即为纯酶制剂。5、酶活性及蛋白质含量的测定方法酶活性测定方法测定前将酶液稀释300-500倍，吸1mL酶液，加入2mL联苯铵醇的醇的钠缓冲液(在200mL容量瓶中，先加入2/3重蒸馏水及2.3mL冰乙酸和184mg联苯铵，在50-60℃水浴中加热溶解，然后加入5.45g无水醇的钠。待完全溶解后，冷却，定容)，在28-32℃水浴中保温5min，测定时，加入1mL 0.1mol/LH2O2，立即摇匀，并转入比色皿中，用分光光度计在波长580nm下测定光密度的变化。以加入过氧化氢起计时，每15秒钟读数一次。E＝(O.D45秒-O.D15秒)×2×稀释倍数/1000酶活单位为O.D/ng蛋白×min蛋白质含量测定方法按考马斯亮蓝G-250法。
本发明优点；1、料来源广泛，廉价；2、生产的废水中含有丰富的N、P、K元素，可作为化学肥料，对土壤无副作用，无环境污染；投资少，效益大，每10万元投入可生产出100万元的酶产品。
3、资少，效益大，每10万元投入可生产出100多万元的酶产品。
权利要求
1.从甘蔗的嫩叶中提取过氧化物酶的方法，其特征在于以甘蔗嫩叶为原料，原料清洁后，加入预冷4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸钾抽提液匀浆抽提；原料与抽提液的比例为1∶2(重量与体积比)，匀浆后过滤，弃去滤渣，取滤液，于滤液中加入固体硫酸铵，边加边搅拌至饱和度达40％，置0-4℃下静置后以4000rpm离心；弃沉淀得清液，在清液中再加入固体硫酸铵，边加边搅拌至饱和度达80％，置0-4℃下静置后以4000rpm离心；弃清液，得沉淀物，沉淀物即为粗酶；于粗酶中加入4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸钾缓冲液，粗酶与缓冲液加入量的比例为1-2∶50(g/v)，装入透析袋中，放入重蒸馏水在4℃下透析直至硫酸铵透析完毕为止；透析后于4000rpm离心，弃沉淀，所得的上清液置于冰浴中，不断搅拌，慢慢加入1倍体积预冷至-15℃乙醇溶液，静置后4000rpm离心，弃去沉淀，于上清液再加入原上清液的1倍体积-15℃乙醇溶液，静置后4000rpm离心，收集沉淀，将沉淀溶于预冷4℃的0.05mol/L pH＝7.0磷酸钾缓冲液中，在重蒸馏水中透析除去乙醇。可得到R2值近于1的酶溶液；将酶溶液经Sephadex G-100层析柱层析，用pH6.8 0.02mol/L磷酸钾缓冲液洗脱，自动部分收集器收集，恒流泵恒流，收集呈酶活性的洗脱液，将洗脱液在4℃下超滤，冻干，即为纯酶制剂。
全文摘要
过氧化物酶(POD)提取方法,以甘蔗嫩叶为原料,以预冷的磷酸钾缓冲液匀浆、过滤,上清液用硫酸铵分级分离,冻干成粗酶。用预冷的磷酸钾缓冲液溶解沉淀并对重蒸馏水透析,离心,上清液用－15℃酒精沉淀,静置后,在冰冻离心机中离心收集沉淀,将沉淀溶于少量缓冲溶液中,透析除酒精。透析液经Sephadex G－100柱层析、洗脱液浓缩,可得部分纯酶。本方法可生产出R2=3的高纯度的过氧化物酶,作为标记酶使用。原料来源广、廉价。
文档编号C12N9/08GK1369557SQ02114970
公开日2002年9月18日 申请日期2002年3月18日 优先权日2002年3月18日
发明者何平, 傅雪琳, 高向阳, 徐凤彩 申请人:华南农业大学