一种用于确定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)侵染小麦组织的染色方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及真菌染色技术，特别是一种采用Wheat Germ Agglutinin, Alexa F丨uorK 488Conjugate(WGA_AF 488)染剂标记小麦黑糖菌（Tilletia controversa KUhn)从而确定小麦组织是否被侵染的方法。
【背景技术】
[0002] 小麦矮腥黑穗病菌（Tilletia controversa Kilhn, TCK)属真菌界黑粉菌科腥黑粉 菌属，是引起的小麦矮腥黑穗病是一种重要的国际检疫性病害，对小麦生产造成严重的危 害，也是我国外来生物入侵研究的主要物种之一。
[0003] 基于形态学观察和鉴定目的的常见的真菌染色方法包括：高碘酸无色品红法 (PAS法）、HE染色、六胺银法（GMS法）、黏液胭脂红法（Mucincarmine法）、阿尔辛蓝法（AB 法）、无色品红醛品红法（Gridley法）等，但这些方法都不能获得较好的TCK染色效果。
[0004] 现有技术中存在一种根据黑穂病菌的自发荧光显微学特性甄别小麦矮腥黑穗病 菌和小麦网腥黑穗病菌（T. carves Tul.，TCT)的方法，即，在Strockwell等人的方法上做 了相应的改进，能够在观察数量足够多的情况下很好地鉴别TCK和TCT。
[0005] 同样属于黑粉菌科的茭白黑粉菌，现有技术中有一种快速观察其菌丝的方法，即 Latude-Dada(1996)方法的改进，包括：首先在脱色液（0. 15%三氯乙酸溶解在3 : l(w/v) 的乙醇和氯仿混合液中）中脱色，蒸馏水漂洗3次后，用0. 025%苯胺蓝乳酚油染色液进行 染色，然后置于激光共聚焦显微镜下观察即可。
[0006] 然而，目前该领域尚未存在一种能够实现在任意生长阶段的各种小麦组织中获得 较好的黑穂菌染色效果并确认该小麦组织是否被侵染的方法。
【发明内容】
[0007] 基于本领域如上所述的空白和需求，本发明提供了一种用于确定小麦黑穗菌 (Tilletia controversa KUhn)侵染小麦组织的染色方法。技术方案如下：
[0008] -种用于确定小麦黑穗菌（Tilletia controversa Kilhn)侵染小麦组织的染色方 法，包括如下步骤：
[0009] (1)固定：取不同生长时期的小麦组织样品，在无水乙醇固定液浸泡不少于24h ;
[0010] (2)染色：将样品先置于含 10 μ g/ml Propidium Idodide 和 0· 〇2% Tween2O 的 A 染色液中浸泡15min，然后置于20 μ g/ml WGA-AF 488的B染色液中20min，最后用I XPBS pH 7. 4冲洗；
[0011] (3)将处理后样品置于载玻片上加盖玻片倒置后在激光共聚焦显微镜下观察是否 有菌丝侵染。
[0012] 所述小麦组织样品指叶片、茎杆、花药或子房。
[0013] 所述小麦组织样品指叶片，需剪段成5mm左右的方块且去掉四周边缘。
[0014] 所述小麦组织样品指孕穗期样品，需分离子房和花药。
[0015] 所述的染色方法在用于确定小麦黑穗菌侵染小麦组织方面的应用。
[0016] 一种用于确定小麦黑穗菌侵染小麦组织的试剂盒，特征在于，包括:A染色液和B 染色液，A染色液是含10 μ g/ml Propidium Idodide的0· 02% Tween20溶液，B染色液是 20 μg/ml WGA-AF 488。
[0017] 所述试剂盒还包括用于细胞学实验的常规试剂：1XPBS pH 7. 4、无水乙醇、蒸馏 水。
[0018] -种用于确定小麦黑穗菌侵染小麦组织的试剂盒的生产方法，其特征在于，组装 试剂盒的试剂中包括A染色液和B染色液，A染色液是含10 μ g/ml Propidium Idodide的 0· 02% Tween20 溶液，B 染色液是 20 μ g/ml WGA-AF 488〇
[0019] 组装试剂盒的试剂中还包括IXPBS pH 7. 4、无水乙醇、蒸馏水。
[0020] 本发明请求保护一种用于确定小麦黑穗菌（Tilletia controversa KUhn)侵染小 麦组织的染色方法，包括如下步骤：（1)固定：取不同生长时期的小麦组织样品，在无水乙 醇固定液中充分浸泡；（2)染色：将样品先置于含10 μ g/ml Propidium Idodide和0. 02% Tween20的溶液中浸泡15min，然后置于20μg/ml WGA-AF 488的染色液中20min，最后用 IXPBS pH 7.4冲洗；（3)将处理后样品置于载玻片上加盖玻片倒置后在激光共聚焦显微 镜下观察是否有菌丝侵染。该方法的技术原理如下：麦胚凝集素（WGA)是一种在细胞生物 学中的应用最为广泛的外源凝集素 。Alexa FIuorK 488共辄WGA具有明亮的绿色荧光（激 发/发射波长为495/519nm)，它具有与真菌胞壁的几丁质相结合的特性，因此利用该染色 剂能很好地实现对黑穂菌的标记功能。
[0021] 该方法首次使用WGA-AF 488染剂标记小麦矮腥黑穗菌丝，Propidium Idodide 染剂用来浸染小麦组织，在激光共聚焦显微镜下观察到小麦各个生长时期的不同组织中的 TCK侵染情况，用于确定所测小麦组织对应的小麦植株是否感染了 TCK。上述步骤十分简 单、便捷，无需特殊的实验条件和处理手段，在一般的实验环境中均能操作实现，且便于推 广。
[0022] 进一步地，所述小麦组织样品指叶片、茎杆、花药或子房；采用本发明的染色方法， 可以使用小麦各个部位的组织作为样品进行染色，突破了不同生长时期对于小麦组织取样 的局限性，能够通过简单便捷的方式在小麦生长的任一阶段取样染色并获知确认所测小麦 是否感染TCK。
[0023] 进一步地，所述小麦组织样品指叶片，需剪段成5_左右的方块且去掉四周边缘， 有利于染色剂从四周进入细胞内。
[0024] 进一步地，所述小麦组织样品指孕穗期样品，需分离子房和花药；该步骤可以实现 在小麦孕穗期取样以确定该孕穗期小麦植株是否被黑穂菌侵染。
[0025] 本发明通过实验数据表明，通过本发明提供的染色方法，能够对小麦各生长时期 的感染组织进行成功染色，并获得清晰的染色效果。
[0026] 根据市场需求，本发明还请求保护基于所述染色方法的用于确定小麦黑穗菌侵染 小麦组织的试剂盒。组装所述试剂盒的试剂包括规格如下的染色剂：A染色液：含10 μ g/ ml Propidium Idodide 的 0· 02% Tween20 溶液，B 染色液：20 μ g/ml WGA-AF 488 ;所述试 剂进一步地还包括用于细胞学实验的常规试剂，如IXPBS pH 7. 4、无水乙醇、蒸馏水等。采 用所述试剂盒按照本发明染色方法的步骤对小麦组织样品进行染色，同样能在各时期不同 的小麦组织中获得清晰的染色效果，并确认所测组织对应的小麦有没有感染黑穂菌。
[0027] 本发明还请求保护上述试剂盒的生产方法，即任何规模的基于商业目的的组装或 生产上述用于确定小麦黑穗菌侵染小麦组织的试剂盒的行为均属于本发明的保护范围。
[0028] 综上所述，采用本发明的染色方法能够实现在任意生长阶段的各种小麦组织中获 得较好的黑穂菌染色效果并确认该组织对应的小麦植株是否被黑穂菌侵染，同时在对于研 究小麦矮腥黑穗病的侵染循环方面，由于在目前国内外开展的一些对小麦矮腥黑穗病侵染 循环对的研究中，尚未见采用此方法获得黑穂菌侵染循环染色结果的报道，因此本发明所 述的方法更具有实际应用意义。本发明的染色方法具有操作简单、便捷、有