专利名称：黑麦草腥黑粉菌检测标准分子及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种口岸检验检疫、农业生产、植物保护领域检测用的标准分子，特别是涉及一种黑麦草腥黑粉菌检测用标准分子及其制备方法。
背景技术：
黑麦草腥黑粉菌(Tilletia walkeri Castebury&Carris)是一种与小麦印度腥黑穗病菌在形态特征上极为相似的真菌，主要为害黑麦草。该菌分布于美国、澳大利亚、新西兰、加拿大、丹麦、荷兰、日本、西班牙等地，我国尚未有报道。黑麦草腥黑粉菌于1996年在美国农业部展开的对小麦印度腥黑穗病菌的大普查中于美国俄勒R州和东南部诸州的小麦种子洗涤液中首次发现，1999年Castlebury等根据其在形态特征上及生物学上与小麦印度腥黑穗病菌的微弱差别进行鉴定，并将其命名。该菌与小麦印度腥黑穗病菌形态学特征和分子学特征都十分相似，并且在实验室人工接种条件下可侵染小麦(Mathre et al, 2000)。黑麦草腥黑粉菌与小麦印度腥黑穗病菌冬孢子在大小和颜色上较为接近，只是前者的孢子外壁纹饰比较粗，孢壁具有脑纹结构(Castlebury etal.，1997)。章桂明等对小麦印度腥黑穗病菌及其近似种的冬孢子的形态特征在扫描电镜下进行了比较，认为两者形态学特征非常接近，只获得少量孢子的情况下难以从形态学方面将两菌进行区别，需要较多的孢子综合分析才能得出结论(章桂明，1999)。在分子生物学方面，Larocthe等应用AFLP方法来区别小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌，建立了区别小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌的AFLP方法(Larocthe et al.，1997)。Pimentel等利用RAPD和PCR-RFLP的分析方法研究了黑麦草腥黑粉菌及其近似种，结果表明黑麦草腥黑粉菌的特有酶切位点是Sca I，它与小麦印度腥黑穗病菌之间的相似性达到85% ；而RAPD方法的研究结果则显示当软件的支持率为100%时，这两种菌之间仅有25%的相似性(Pimentel et al.，1998)。McDonald等利用r印-PCR基因指纹技术对黑麦草腥黑粉菌及其近似种的基因组DNA进行了分析，得到其基因组指纹图谱，通过 GeCompar (4. 0)软件分析成功的将黑麦草腥黑粉菌和小麦印度腥黑穗病菌及其它近似种和相关种区分开(McDonald et al.，2000)。上述检测方法由于对实验操作要求比较高，而且重复性差，在实际操作中难以推广应用。因此Frederick等在Ferreira研究的基础上进一步分析了小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌2. 3kb的线粒体DNA，并设计了扩增扩增黑麦草腥黑粉病菌的3对特异性引物，建立了黑麦草腥黑粉病菌常规PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法(Frederick et al.，2000)。程颖慧等对2. 3kb的线粒体序列分析，分别设计了扩增小麦印度腥黑穗病菌的4对特异性引物和扩增黑麦草腥黑粉菌的2对特异性引物，对ITS序列进行分析设计了扩增所有供试材料的通用引物，建立了两种菌的常规PCR检测方法、双重PCR的检测技术、单孢PCR的检测方法、实时单色荧光PCR检测方法以及小麦印度腥黑穗病菌的实时双色荧光PCR检测方法(程颖慧等，2002)；易建平等对ITS序列进行分析设计了扩增所有供试材料的通用引物，利用套式PCR检测方法对冬孢子进行检测，
3建立了黑麦草腥黑粉菌的套式PCR检测方法(易建平等，2003)。章桂明等Q005)对黑麦草腥黑粉菌和小麦印度腥黑穗病菌分子检测方法进行研究，并在上述基础上制定了黑麦草腥黑粉菌实时荧光PCR检测方法国家标准。 分子生物学检测方法在实际检测过程中需要阳性参考物质作为对照，用以实验结果的分析和判定，确保实验结果的可靠性。现阶段黑麦草腥黑粉菌分子检测所用的阳性参考物质通常是其基因组DNA。但基因组DNA获取过程较复杂，制备非常不方便，其稳定性也尚不能满足长期及经常性使用的需要，并且由于不同检测实验室间使用的基因组DNA来源不同，提取质量存在差异，使得不同实验室的检测结果缺乏可比性和重复性，从而制约了黑麦草腥黑粉菌检测标准及其它分子检测方法的推广应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种制备简便、特异性强、具有良好均勻性和稳定性的黑麦草腥黑粉菌检测标准分子。本发明的另一目的在于提供上述标准分子的制备方法。本发明的再一目的在于提供上述标准分子的检测方法。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了一种黑麦草腥黑粉菌检测标准分子，所述标准分子为能够进行复制的质粒，且所述质粒含有以下序列A和序列B中的至少一种，所述序列A与Genebank中编号为AF218061的序列99. 65%同源；所述序列B与Genebank中编号为AF399887的序列100%同源。在本发明具体的实施方式中，所述序列A为kq ID No. 1所示的序列，所述序列B Skq ID No. 2所示的序列。所述质粒优选为T载体，更优选为pMD19-T。本发明还公开了上述黑麦草腥黑粉菌检测标准分子的制备方法，所述方法包括 以黑麦草腥黑粉菌DNA为模板进行PCR扩增，所述PCR扩增的引物包括下述引物对a和引物对b中的至少一对，将扩增得到的DNA序列转化质粒，引物对a:Seq ID No. 3 5' -TGGGCTGAGTCTGAGATGC-3‘Seq ID No. 4 5' -AGTAATACCTGCGTCTCATAGC-3‘引物对b:Seq ID No. 5 5' -TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘Seq ID No. 6 5' -GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3‘。在本发明具体的实施方式中，是采用所述引物对a和引物对b分别进行PCR扩增， 将引物对a扩增得到的片段与pMD19-T载体进行连接，将连接后得到的重组子以及引物对b 扩增得到的片段分别用限制性内切酶)(bal和KpnI进行双酶切，分别回收酶切产物的大片段，将回收的片段进行连接。本发明还公开了上述黑麦草腥黑粉菌检测标准分子的检测方法，所述方法包括， 利用特异性检测引物和探针，以所述标准分子为模板进行实时荧光PCR反应，并且所述探针5'端和3'端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
所述特异性检测引物分别含有kq ID No. 7和kq ID No. 8所示的序列，探针含有kq ID No. 9所示的序列Seq ID No. 7 5' -CTCGAGCCACTCCGTTGG-3‘Seq ID No. 8 5' -GACAACTCCAGTGATGGCTCC-3‘Seq ID No. 9 5' -TACTCTTCATTGCCCTCA-3‘由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于利用本发明的方法制备得到的黑麦草腥黑粉菌检测标准分子，具有可以长期稳定保存、高拷贝数、易获得、纯度高和制备方便等特点，并且制备简便、特异性强、具有良好的均勻性和稳定性，可以替代黑麦草腥黑粉菌的基因组DNA用于黑麦草腥黑粉菌的定性PCR、 定量PCR检测及分析，解决了黑麦草腥黑粉菌检测中标准分子缺乏的难题。该标准分子适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
图1为本发明所述标准分子示意图。图2为以引物MP3-1、MP3-2和探针MPb3对本发明所述标准分子以及黑麦草腥黑粉菌基因组DNA的实时荧光PCR特异性检测结果图。图3为以引物MP3-1、MP3-2和探针MPb3对本发明所述标准分子的实时荧光PCR
灵敏度检测结果图。图4为以引物MP3-1、MP3-2和探针MPb3对本发明所述标准分子的实时荧光PCR 扩增标准曲线。图5为本发明所述标准分子测序结果与网上公布的黑麦草腥黑粉菌及其近似种线粒体2. 3kb序列比对结果。图6为本发明所述标准分子测序结果与网上公布的黑麦草腥黑粉菌ITS序列比对结果。
具体实施例方式以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例1黑麦草腥黑粉菌检测标准分子的构建一、实验试剂1、供试菌株小麦印度腥黑穗病菌截获来自巴西、印度和墨西哥小麦，黑麦草腥黑粉菌截获自美国小麦，上述供试菌株均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术研究中心保存 (表 1)。表1供试菌株
权利要求
1.一种黑麦草腥黑粉菌检测的标准分子，其特征在于所述标准分子为能够进行复制的质粒，且所述质粒含有以下序列A和序列B中的至少一种，所述序列A为kq ID No. 1所示序列；所述序列B为kq ID No. 2所示序列。
2.根据权利要求1所述的标准分子，其特征在于所述序列A为kqlDNo. 1所示序列与Genebank中编号为AF218061的黑麦草腥黑粉菌2. 3kb序列99. 65%同源；所述序列B为 Seq ID No. 2所示序列与编号为AF399887的黑麦草腥黑粉菌ITS序列100%同源。
3.根据权利要求1 2任意一项所述的标准分子，其特征在于所述质粒为T载体。
4.根据权利要求3所述的标准分子，其特征在于所述T载体为pMD19-T。
5.权利要求1 4任意一项所述的黑麦草腥黑粉菌检测标准分子的制备方法，所述方法包括以黑麦草腥黑粉菌DNA为模板进行常规PCR扩增，所述PCR扩增的弓|物包括下述弓| 物对a和引物对b中的至少一对，将扩增得到的DNA序列转化质粒，引物对a:Seq ID No. 3:5' -TGGGCTGAGTCTGAGATGC-3‘Seq ID No. 4:5' -AGTAATACCTGCGTCTCATAGC-3‘引物对b :Seq ID No. 5:5' -TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘Seq ID No. 6 5' -GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3‘。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于采用所述引物对a和引物对b分别进行PCR扩增，将引物对a扩增得到的片段与PMD19-T载体进行连接，将连接后得到的重组子以及引物对b扩增得到的片段分别用限制性内切酶^CbaI和KpnI进行双酶切，分别回收酶切产物的大片段，将回收的片段进行连接。
7.权利要求1 4任意一项所述的黑麦草腥黑粉菌检测标准分子的检测方法，所述方法包括，利用特异性检测引物和探针，以所述标准分子为模板进行实时荧光PCR反应，并且所述探针5'端和3'端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。所述特异性检测引物分别含有^^ ID似.7和％(1 ID No. 8所示的序列，探针含有％(1 ID No. 9所示的序列SeqIDNo. 75'-CTCGAGCCACTCCGTTGG-3‘SeqIDNo. 85'-GACAACTCCAGTGATGGCTCC-3SeqIDNo. 95'-TACTCTTCATTGCCCTCA-3‘
全文摘要
本发明公开了一种黑麦草腥黑粉菌检测的标准分子，为能够进行复制的质粒，且所述质粒中含有序列A(Seq ID No.1)和序列B(Seq ID No.2)中的至少一种。序列A与黑麦草腥黑粉菌线粒体DNA一段2.3kb的核酸序列同源性为99.65％，B与黑麦草腥黑粉菌核糖体内转录间隔区的DNA序列同源性为100％。本发明还公开了上述标准分子的制备方法和检测方法。本发明中构建的标准分子可以代替黑麦草腥黑粉菌DNA作为黑麦草腥黑粉菌分子检测的阳性对照，该标准分子适用于对黑麦草腥黑粉菌的定性PCR和定量PCR检测。该标准分子适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
文档编号C12Q1/68GK102212611SQ20101014903
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月6日 优先权日2010年4月6日
发明者向才玉, 李小焦, 王颖, 程颖慧, 章桂明, 陈枝楠 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心, 深圳市检验检疫科学研究院