专利名称：一种培育抗旱性增强的黑麦草的方法
技术领域：
本发明的目的是提供一种培育抗旱性增强的黑麦草的方法。
背景技术：
我国北方属于干旱半干旱地区，由于降水不足、淋溶作用弱、地下水的蒸发和蒸腾强烈或降雨给土壤带入盐分，土壤的干旱、盐渍化问题非常严重。这一问题在草坪草上的具体表现就是造成泛斑、春季发芽晚、秋季早衰、生长不良等现象发生，影响草坪的美观，降低草坪的价值。目前北方城市绿化用的草坪草品种尽管本身具有一定的防御干旱、低温的能力，但是由于草坪种植对土壤和水分的要求过高，造成了种植、管理的成本太大，这些因素严重限制了草坪草的使用，又因其在保持水土、防止沙尘、城市绿化方面有着不可替代的作用，所以，研究培育出新型抗干旱草坪草品种显得由为紧迫。由于干旱胁迫抗性属于数量性状，采用常规育种技术培育抗旱品种，耗时费力，困难大。与传统育种方法相比，利用分子育种，改良或增加一个关键的转录因子可以提高植株多方面的抗逆性。
植物在受到逆境(干旱、高盐、低温)胁迫时，会产生一系列蛋白来保护自已免受伤害，以维持活力。目前，利用模式植物拟南芥菜研究逆境因素诱导产生的系列蛋白颇为深入，Mie Kasuga等发现拟南芥菜在受到干旱、高盐、低温等逆境因素胁迫时，会激活与之相关的转录因子如DREB(DRE，dehydration responsiveelement，binding protein)/CBF(C-repeat/DRE-binding factor)，启动相应抗性基因的转录，如DREB1A、rd29A、kin1、cor6.6、cor15a、rd17、P5CS、erd1、rd22、rd29B等，从而大大提高了植株在逆境下的生存能力(Foolad MR，LP Zhang，Lin GY.Identification and validation of QTLs for salt tolerance duringvegetative growth in tomato by selective genotyping.Genome，2001，44444-454)，刘强等将DREB1A基因转到拟南芥菜中，正常环境下可以表达出蛋白，而且在干旱、低温处理的条件下其表达量比野生型显著增强，表明植物中同一转录因子可以通过相应的顺式作用元件同时调控多个基因表达。在干旱条件下，rd29B是表达明显的蛋白之一(Foolad MR，LP Zhang，Lin GY.Identification andvalidation of QTLs for salt tolerance during vegetative growth in tomatoby selective genotyping.Genome，2001，44444-454)，在其启动子序列中至少存在一个依赖于ABA的干旱反应的顺势作用元件，而且在高盐和低温的条件下都可以诱导rd29B的表达(刘强赵南明等.DREB转录因子在提高植物抗逆中的作用。科学通报，2000，45(1)11-16)。
DREB、CBF转录因子属于目前已发现的AP2/EREBP家族中的EREBP型转录因子，包括DREB1A～C(CBF3，1，2)和DREB2A～B等许多成员。它们都含有AP2/EREBP结构域，两者都能与核心序列DRE元件结合。CBF转录因子是能够识别抗冻基因COR(cold-regulated gene)中的CTR/DRE元件并与之结合，从而开启系列抗逆蛋白表达。目前，已经分离出一系列CBF家族成员，CBF1、CBF2、CBF3和CBF4。其中CBF1、CBF2、CBF3基因又分别被命名为DREB1B、DREB1C和DREB1A(Eric J.Stockinger，etal.Transcriptional adaptor and histone acetyltransferase proteins inArabidopsis and their interactions with CBF1，a transcriptional activatorinvolved in cold-regulated gene expression.Nucleic Acids Res.，2001，291524-1533；Volker Haake，Daniel Cook，Jose′Luis Riechmann，Transcriptionfactor CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis.PlantPhysiology，2002，130639-648)。已经有大量证据可以证明，将DREB、CBF转录因子基因通过转入植物中可以明显提高植物的抗旱、抗低温、抗盐等逆境胁迫的能力。
选择启动子来表达转录因子蛋白需要考虑转基因植株的生长发育问题，刘强等使用组成型的强启动子35S超表达转录因子DREB1A蛋白导致了拟南芥菜植株出现生长阻碍、倒伏、结实少的现象，因而这可能是由于在非胁迫条件下DREB1A蛋白控制的胁迫诱导基因表达过多造成的(Mie Kasug，Qiang Liu，Setsuko Miura，etal.Improving plant drought，salt，and freezing tolerance by gene transferof a single stress-inducible transcription factor.Nature Biotechnology1999，17287-292)。因此，抗旱基因能否成功转入，目的基因能否表达，受体植株能否表现出外源基因所控制的性状，还需要通过一系列的实验来鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育抗旱性增强的黑麦草的方法。
本发明所提供的培育抗旱性增强的黑麦草的方法，是将DREB转录因子的编码基因插入植物表达载体，得到含有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入黑麦草中，得到抗旱性增强的黑麦草。
所述黑麦草是指禾本科黑麦草属植物，包括多年生黑麦草和一年生黑麦草在内的20多种。
所述植物表达载体可为Ti类质粒载体或病毒载体或基因枪转化用常规载体。
所述DREB转录因子的编码基因可来源于拟南芥菜或小麦或水稻或玉米或大豆或油菜等。
所述DREB转录因子的编码基因优选为来源于拟南芥菜或小麦。
所述DREB转录因子的编码基因为来源于拟南芥菜的DREB1B基因，如具有Genbank Access No.AB013816的核苷酸序列；或为具有Genbank AccessNo.AB013816的自5′端第612至1320位碱基的DNA片段。为了便于插入表达载体，可在5′设计加上BamHI位点，在3′端设计加上SacI位点，序列全长727bp，如序列表中的序列1，自5′端第1位至第6位脱氧核苷酸为BamHI识别位点，自5′端第722位至第727位脱氧核苷酸为SacI识别位点。
所述DREB转录因子的编码基因为来源于小麦的CBF1基因，具有GenbankAccess No.AF376136的序列，或具有Genbank Access No.AF376136的自5′端第8至657位碱基的DNA片段。为了便于插入表达载体，可在5′设计加上BamHI位点，在3′端设计加上SacI位点，序列全长669bp，如序列表中的序列2。
在所述重组表达载体中，启动所述DREB转录因子的编码基因转录的启动子是拟南芥菜亲水蛋白RD29B基因的启动子，或拟南芥菜亲水蛋白RD29A基因的启动子，或拟南芥菜水杨酸诱导基因SAG12等胁迫诱导型启动子；或玉米polyubiqutin基因启动子，或花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子等组成型启动子。
所述拟南芥菜亲水蛋白RD29B基因的启动子，含Genbank Access No.D013044的自5′端第85至1784位碱基的DNA片段。为了便于插入表达载体，可在5′设计加上HindIII位点，在3′端设计加上BamHI位点，序列全长1706bp，如序列表中的序列3。
所述含有CBF1转录因子的编码基因的重组表达载体为将所述CBF1转录因子的编码基因插入pBPC18的限制性内切酶位点BamHI和SacI的识别位点间得到的重组表达载体pBAC117；或为将所述RD29B启动子插入pBAC117的限制性内切酶位点HindI和BamHI的识别位点间得到的重组表达载体pBAC122；或为质粒pBAC122用HindIII酶切，插入两端为HindIII粘性末端的CaMV 35S启动子与玉米Adh1intron驱动的bar基因以及以NOS 3’为终止子的片段，得到的质粒pBAC127。
所述含有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体为将所述DREB转录因子的编码基因插入pBPC18的限制性内切酶位点BamHI和SacI的识别位点间得到的重组表达载体pBAC118；或为将所述RD29B启动子插入pBAC118的限制性内切酶位点HindI和BamHI的识别位点间得到的重组表达载体pBAC123；或为将pBAC123用HindIII酶切，插入两端为HindIII粘性末端的CaMV 35S启动子与玉米Adh1 intron驱动的bar基因以及以NOS 3’为终止子的片段，得到的质粒pBAC128。
所述方法中，是以黑麦草成熟胚或幼胚为外植体，将含有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体导入黑麦草。
携带有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体可通过基因枪法、使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化黑麦草细胞或组织。
所述携带有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体优选通过基因枪法导入黑麦草。
本发明的方法，特别适合于多年生黑麦草，尤其是神枪手品种。
本发明以黑麦草代表性品种-草坪专用型多年生黑麦草品种神枪手(Topgun)为材料，将由拟南芥菜亲水蛋白RD29B基因的启动子驱动的DREB转录因子的质粒pBAC122(含CBF1基因)，pBAC123(含DREB1B基因)，pBAC127(含CBF1基因)，pBAC128(含DREB1B基因)导入多年生黑麦草品种Topgun的幼胚、成熟胚愈伤组织中。经除草剂Bialaphos抗性筛选和植株再生，最终获得了98棵转基因植株。经PCR、Dot-blotting的分子检测，CBF1基因和DREB1B基因分别已整合到多年生黑麦草部分转基因株系的基因组中。用五种不同浓度的除草剂涂抹黑麦草叶片，非转基因植株表现为不抗，而转基因植株最高可以抗到135-200mg/L。叶片脯氨酸含量测定表明，62个转DREB1B基因株系中有31株脯氨酸含量高于非转基因植株，36个转CBF1基因株系中有13株的脯氨酸含量高于非转基因植株，部分植株提高幅度可达2-4倍。经过25天人工温室干旱处理，有9棵植株显示了存活迹象，复水后，有4棵植株恢复生长。实验结果表明，利用逆境诱导型启动子(RD29B)来增强外源DREB1B、CBF1基因的表达，能显著改良黑麦草的抗旱能力。
图1为表达载体示意2为愈伤组织分化出苗照片图3为除草剂抗性筛选获得转基因植株照片图4为部分T0代转DREB1B基因植株的PCR检测图5为部分T1代转DREB1B基因植株的点杂交分析图6为部分转CBF1基因株系的PCR检测图7为部分转CBF1基因株系的点杂交分析图8为部分转pBAC128基因株系的脯氨酸含量分析图9为部分转CBF1基因株系的脯氨酸含量分析图10为转基因黑麦草株系的除草剂抗性分析图11a为复水后的转基因株系123-21图11b为复水后的转基因株系122-7图12为128-14的正常生长植株照片具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
T0表示由黑麦草的愈伤组织得到的转基因植株，T1表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株。
实施例1、培育抗旱性增强的黑麦草Taq DNA聚合酶购于TaKaLa公司，T4DNA连接酶、T-easy vector、限制性内切酶、DNA回收纯化试剂盒等购于Promega公司，常规试剂、有机试剂均过于万源化学试剂公司，基因枪及其试剂耗材购于BIORAD公司。
一、植物表达载体的构建1、DREB1B基因表达载体pBAC123和pBAC128的构建(1)拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)DREB1B基因的克隆根据已发表的拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)的DREB1B基因序列(GenbankAccess No.AB013816)，设计并合成该基因的特异引物P1上游引物5′-GGATCCTGATCAATGAACTCATTTTC，下游引物P25′-GAGCTCCCATTCTAAAAAAGGAAC，以拟南芥菜的基因组DNA(还是cDNA)为模板，利用PCR克隆出该基因。其中，PCR的温度条件为先94℃预变性5min；然后94℃变性45s，45℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。将扩增得到的约730bp DNA片段用DNA回收纯化试剂盒回收该片段，用pGEM-T easy vector系统(Promega公司，美国)按供应商提供的方案克隆该片段，测序(上海申友生物技术公司)，测序结果表明，该片段具有序列表中序列1的核苷酸序列。通过与DREB基因序列(Genbank Access No.AB013816)比较，证实克隆到具有Genbank AccessNo.AB013816的自5′端第612至1320位基因序列片段。
(2)DREB1B基因表达载体pBAC123和pBAC128的构建质粒pBAC123和pBAC128的构建方法、过程及基因转化参照《分子克隆》第二版(Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular Cloning-A LaboratoryManual.2nd ed.New YorkCold Spring Harbor laboratory Press，1989)。
具体方法如下1)用SacI和EcoRI双酶切质粒pSP72(购自Promega公司)，插入约260bp的根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS 3’终止子序列(从质粒载体pBARGUS，用SacI和EcoRI双酶切，Vasil，et al，Bio/technology，10667-674，1992)。构建成的质粒定名为pBPC18。
2)由PCR克隆获得的约730bp DREB基因片段，采用TA克隆方法插入pGEM-T(Promega)，经DNA测序验证正确后，用BamHI和SacI双酶切，插入pBPC18的BamHI和SacI位点。构建成的质粒定名为pBAC118。
3)由拟南芥菜的基因组DNA为模版，上游引物P15′-GCGGAAGCTTCATTTTCTGCTACAG，下游引物P25′-GGATCCTTTCCAAAGCTGTGTTTTCTCTTTTTC进行PCR克隆获得的1.7kb RD29B启动子片段(Genbank Access No.D013044的自5′端第85至1784位碱基的DNA片段)，采用TA克隆方法插入pGEM-T(Promega)，经DNA测序验证正确后，用HindIII和BamHI双酶切，插入pBAC118的HindIII与BamHI位点之间。构建成的质粒定名为pBAC123。
4)质粒pBAC123用HindIII酶切，插入两端为HindIII粘性末端的CaMV 35S启动子与玉米Adh1 intron驱动的bar基因以及以NOS 3’为终止子的片段(Vasil，et al，Bio/technology，10667-674，1992)。构建的质粒正向插入定名为pBAC128(图1)，反向插入定名为pBAC128R。pBAC128的目的基因DREB1B以拟南芥菜亲水蛋白RD29B基因的启动子(1.7kb)为驱动，即为逆境诱导表达类型。pBAC128含有CaMV 35S启动子和玉米Adh1基因的Intron1驱动的bar基因作为选择标记。
2、CBF1基因表达载体pBAC122和pBAC127的构建(1)小麦(Triticum aestivum)CBF1基因的克隆根据已发表的小麦(Triticum aestivum)的DREB1B基因序列(Genbank AccessNo.AF376136)，设计并合成该基因的特异引物P3上游引物5′-GGATCCCAACTGATGGACACCGCCGCTGCCGGC，下游引物P45′-GAGCTCTTAGTCGGATAATTAGTTCCAAAGCGG，以小麦品种京花1号的基因组DNA为模板，利用PCR克隆出该基因。其中，PCR的温度条件为先94℃预变性5min；然后94℃变性45s，45℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。将扩增得到的约670bp DNA片段用DNA回收纯化试剂盒回收该片段，用pGEM-T easy vector系统(Promega公司，美国)按供应商提供的方案克隆该片段，测序(上海申友生物技术公司)，测序结果表明，该片段具有序列表中的序列2的核苷酸序列。通过与DREB基因序列(GenbankAccess No.AF376136)比较，证实克隆到具有Genbank Access No.AF376136的自5′端第8至657位脱氧核苷酸基因序列片段。
(2)CBF1基因表达载体pBAC122和pBAC127的构建质粒pBAC122和pBAC127的构建方法、过程及基因转化参照《分子克隆》第二版(Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular Cloning-A LaboratoryManual.2nd ed.New YorkCold Spring Harbor laboratory Press，1989)。
具体方法如下1)用SacI和EcoRI双酶切质粒pSP72(购自Promega公司)，插入约260bp的根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS 3’终止子序列(从质粒载体pBARGUS，用SacI和EcoRI双酶切，Vasil，et al，Bio/technology，10667-674，1992)。构建成的质粒定名为pBPC18。
2)由PCR克隆获得的约670bp CBF1基因片段，采用TA克隆方法插入pGEM-T(Promega)，经DNA测序验证正确后，用BamHI和SacI双酶切，插入pBPC18的BamHI和SacI位点。构建成的质粒定名为pBAC117。
3)由拟南芥菜的基因组DNA为模版，上游引物P15′-GCGGAAGCTTCATTTTCTGCTACAG，下游引物P25′-GGATCCTTTCCAAAGCTGTGTTTTCTCTTTTTC进行PCR克隆获得的1.7kb RD29B启动子片段(Genbank Access No.D013044的自5′端第85至1784位碱基的DNA片段)，采用TA克隆方法插入pGEM-T(Promega)，经DNA测序验证正确后，用HindI和BamHI双酶切，插入pBAC117的HindIII与BamHI位点之间。构建成的质粒定名为pBAC122。
4)质粒pBAC122用HindIII酶切，插入两端为HindIII粘性末端的CaMV 35S启动子与玉米Adh1 intron驱动的bar基因以及以NOS 3’为终止子的片段(Vasil，et al，Bio/technology，10667-674，1992)。构建的质粒正向插入定名为pBAC127(图1)，反向插入定名为pBAC127R。pBAC127的目的基因CBF1以拟南芥菜亲水蛋白RD29B基因的启动子(1.7kb)为驱动，即为逆境诱导表达类型。pBAC127含有CaMV 355启动子和玉米Adh1基因的Intron1驱动的bar基因作为选择标记。
二、植物表达载体pBAC122、pBAC123、pBAC127、pBAC128转化黑麦草草坪专用型多年生黑麦草品种“神枪手”为受体品种。它的突出特点是生长迅速、坪用性好、耐湿热性强、高抗病虫性(植物内生菌感染率90％以上)。对北方和过渡带气候条件具有广泛的适应性，与其它多年生黑麦草品种或草地早熟禾有极佳的兼容配伍性。
选择黑麦草种子的成熟胚为外植体进行愈伤组织诱导，需要用8mg/L的2，4-D进行预处理，否则成熟胚很难诱导出愈伤组织。具体方法如下其种子经质量百分比浓度为2.8％的次氯酸钠水溶液消毒10分钟后，用含有2mg/L 2，4-D的无菌水浸泡1-2天，种子萌动后，将其成熟胚接种在W14+2，4-D 8mg/L+NAA 4mg/L+KT 0.1mg/L的愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤。结果在诱导出的617块愈伤组织中，有36块愈伤组织在筛选培养基(MS+NAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+Bialaphos2mg/L)上长出绿芽点，绿芽点分化率为5.8％，最终成苗34丛，成苗率为5.8％，图2显示了愈伤组织分化出苗的情况。
用高压氦气基因枪PDS1000(基因枪及其试剂耗材购于BIORAD公司)将重组质粒pBAC122与含有bar基因筛选标记的质粒pBARGUS，或pBAC123与含有bar基因筛选标记的质粒pBARGUS，或pBAC127，或pBAC128分别导入黑麦草愈伤组织，具体操作参照张晓东等(张晓东，梁荣奇，陈绪清，杨凤萍等.优质HMW谷蛋白亚基转基因小麦的获得及其遗传稳定性和品质性状分析.科学通报，2003，48(5)474～479)的方法进行。其中，pBAC122或pBAC123分别与含有bar基因筛选标记的质粒pBARGUS(Vasil，et al，Bio/technology，10667-674，1992)共转化，pBAC122和pBARGUS的摩尔比为4∶1，pBAC123和pBARGUS的摩尔比为4∶1。
将基因枪转化的愈伤组织转入愈伤诱导筛选培养基W14+2，4-D 8mg/L+NAA4mg/L+KT 0.1mg/L+Bialaphos 1mg/L中培养1-2周，诱导出愈伤组织再转入分化筛选培养基MS+NAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+Bialaphos 2mg/L中分化出苗。最后将幼苗在含2mg/L多效唑的壮苗培养基MS+NAA 0.5mg/L+Bialaphos 2mg/L上生根，成苗后移栽至田间。结果表明经2mg/L的除草剂Bialaphos筛选，共获得98株转基因植株(T0代)，其中转CBF1基因的植株有36株，包括转pBAC122的植株28株和转pBAC127的植株8株，转DREB1B基因的植株获得62株，包括转pBAC123的植株8株和转pBAC128的植株54株。转基因黑麦草的除草剂抗性效果如图3。
三、转基因植株的分子分析1、转DREB1B基因植株的PCR检测和点杂交分析
(1)T0代转基因植株的PCR检测CTAB法提取转基因黑麦草植株叶片基因组DNA，以未转化黑麦草植株为阴性对照、质粒pBAC123为阳性对照，PCR产物用1％凝胶电泳检测。转基因植株的PCR检测，使用DREB1B基因上游引物P1和下游引物P2。反应体系为总体积为25μl，10×PCR缓冲液2.5μl，引物(10μM)各1μl，dNTPs 2μl，ddH2O 13μl，Taq酶1U，MgCl22μl，模板DNA 1μg。其循环扩增程序为先94℃预变性5min；然后94℃变性45s，45℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR检测结果表明8株转pBAC123的植株有4株可扩增得到727bp左右的DREB1B基因的特异片段，54株转pBAC128的植株有14株可扩增得到727bp左右的DREB1B基因的特异片段。部分T0代转基因植株的PCR检测结果如图4所示，表明所获得的部分转基因植株(泳道3，4，7，8，10，14等)与阳性对照质粒(泳道1)都能扩增出了727bp左右的DREB1B基因的特异片段，阴性对照(非转基因植株，泳道2)没有扩增带，表明外源DREB1B基因已经进入了转基因植株。图4中，泳道15为Gibco公司1kb plus DNA分子量标准，1为阳性对照，2为阴性对照，其余为转基因植株，其中，泳道3-8为转pBAC123的植株，泳道9-14为转pBAC128的植株。
(2)T1代转基因植株的DNA分子杂交检测将经上述PCR检测得到727bp左右的DREB1B基因的特异片段(PCR检测为阳性)的T0代植株进行种植，获得T1代转基因植株，分别提取叶片基因组DNA，用地高辛(DIG，Roche)标记727bp的DREB基因(该727bp的DREB1B基因是以拟南芥菜的基因组DNA为模板，利用引物P1和P2 PCR扩增得到)作为探针，进行点杂交检测。该点杂交分析，使用Bio-Rad公司Bio-Dot Microfiltration点杂交仪进行点膜，按Roche公司的DIG DNA Labeling and Detection Kit进行杂交和检测，以PCR法对DREB1B基因进行DIG标记。点杂交结果如图5所示，表明有部分点为强信号，部分信号(包括转基因植株)较弱，这说明很可能在黑麦草的基因组中也存在类似的DREB1B转录因子或同源性较高的DNA序列。图5中，点A1阳性对照(pBAC123)，B1空白对照，D8阴性对照CK(未转基因植株)，其余为转基因植株(转pBAC123的植株有4株，转pBAC128的植株有25株)。
2、转CBF1基因植株的PCR检测和点杂交分析(1)T0代转基因植株的PCR检测CTAB法提取转基因黑麦草植株叶片基因组DNA，以未转化黑麦草植株为阴性对照、质粒pBAC122为阳性对照，PCR产物用1％凝胶电泳检测。转基因植株的PCR检测，使用CBF1基因上游引物P3和下游引物P4。反应体系为总体积为25μl，10×PCR缓冲液2.5μl，引物(10μM)各1μl，dNTPs 2μl，ddH2O 13μl，Taq酶1U，MgCl22μl，模板DNA 1μg。其循环扩增程序为先94℃预变性5min；然后94℃变性45s，45℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR检测结果表明28株转pBAC122的植株中有12株可扩增得到649bp左右的CBF1基因的特异片段，8株转pBAC127的植株中有4株可扩增得到649bp左右的CBF1基因的特异片段。部分T0代转基因植株的PCR检测结果如图6所示，表明所获得的部分转基因植株与阳性对照质粒都能扩增出CBF1基因的特异片段，部分植株有非特异带，这可能是由于CBF1引物的特异性不高导致的。图6中，泳道11 Gibco公司1kb plus为DNA分子量标准，9为阳性对照，10为阴性对照(未转基因植株)，其余为转基因植株，其中，泳道1-8为转pBAC122的植株。
(2)T1代转基因植株的DNA分子杂交检测将经上述PCR检测得到690bp左右的CBF1基因的特异片段(PCR检测为阳性)的T0代植株进行种植，获得T1代转基因植株，分别提取叶片基因组DNA，用地高辛(DIG，Roche)标记690bp的CBF1基因(该690bp的CBF1基因是以拟南芥菜的基因组DNA为模板，利用引物P3和P4 PCR扩增得到)作为探针，进行点杂交检测。该点杂交分析，使用Bio-Rad公司Bio-Dot Microfiltration点杂交仪进行点膜，按Roche公司的DIG DNA Labeling and Detection Kit进行杂交和检测，以PCR法对CBF1基因进行DIG标记。点杂交结果如图7所示，表明有部分点为强信号，部分信号(包括转基因植株)较弱，这说明很可能在黑麦草的基因组中也存在类似的CBF1转录因子或同源性较高的DNA序列。图7中，点C-7阳性对照(pBAC122)，B-7空白对照，A-7阴性对照CK(未转基因植株)，其余为转基因植株。
四、黑麦草叶片游离脯氨酸含量的测定1、T0代转DREB1B基因植株的叶片游离脯氨酸含量的测定脯氨酸作为一种抗旱生理指标与植物的抗旱性关系密切。大量证据表明，在干旱、低温高渗等逆境因素条件下，会导致植株体内脯氨酸浓度的迅速增加，从而增强了植株的抗逆性(刘宁，高玉葆，贾彩霞等.渗透胁迫下多花黑麦草叶内过氧化物酶活性和脯氨酸含量以及质膜相对透性的变化.植物生理学通讯，2000，36(1)11-14了；高玉葆，任安芝，刘峰等.黑麦草叶内游离脯氨酸含量对于不同类型和强度的水分胁迫的生理生态响应.植物生理学通讯，1999，23(3)193-204；高玉葆任安芝刘蜂.模拟草地内黑麦草叶游离脯氨酸含量与叶含水量、土壤含水量之间的相互关系研究，南开大学学报(自然科学版)，1999，32(3)169-176)按照文献(徐晓峰，朱才.小麦叶中脯氨酸测定方法的研究，生物技术.1997，7(1)40～42)的方法，测定步骤二获得的62株转DREB1B基因的T0代黑麦草植株叶片游离脯氨酸含量，具体方法如下采用室内模拟干旱条件的方法，植株停止浇水25天后，称取叶片0.1g，剪碎后放入试管中，加5ml 3％(质量百分含量)磺基水杨酸溶液，于沸水浴中浸提10分钟，冷至室温。吸取浸提液2ml于另一试管中，加入2ml水，2ml冰乙酸和4ml 2.5％(质量百分含量)酸性茚三酮溶液(以3∶2的冰乙酸和6mol/L磷酸为溶剂进行配制)，至沸水浴中显色60分钟，冷却至室温。加入4ml甲苯，振荡，以萃取红色物质。静置后，吸取甲苯层于721型分光光度计520nm波长处比色，测其OD值。标准曲线的制作配制浓度为1～10μg/ml的十个系列脯氨酸标准溶液。取标准溶液2ml和2ml 3％磺基水杨酸溶液代替样品测定中的2ml浸提液和2ml水，按上述程序进行显色，萃取和比色(波长520nm)，最后绘制标准曲线。
根据测得的值计算黑麦草叶片游离脯氨酸的含量脯氨酸含量(μg/g)＝C*2.5/W式中C-----以标准曲线获得的被测样品的脯氨酸含量(μg)W-----黑麦草叶片重量(g)2.5---提取脯氨酸时浸提液3％磺基水杨酸体积(5ml)与测定时所取样品液体积(2ml)比62株转DREB1B基因黑麦草干旱处理后叶片脯氨酸含量的测定结果表明，其中1株转pBAC123和30株转pBAC128黑麦草的脯氨酸含量高于对照CK(未转基因植株)，图8中显示了部分转pBAC128植株的测定结果。图8中CK-P为对照(未转基因黑麦草)，其余为转转pBAC128植株。
2、T0代转CBF1基因植株的叶片游离脯氨酸含量的测定按照步骤1的方法对36株步骤二获得的T0代转CBF1基因黑麦草植株进行了干旱处理后叶片脯氨酸含量的测定，结果表明其中8株转pBAC122和5株转pBAC127黑麦草的脯氨酸含量高于对照CK(未转基因植株)，其中有些转基因植株(C127-6、C127-1)的脯氨酸含量比对照要高出2-4倍，图9中显示了部分转CBF1基因植株的测定结果。图9中，C122表示转pBAC122植株，C127表示转pBAC127植株，CK-W和CK为对照(未转基因黑麦草)。
五、转基因植株除草剂抗性检测配置100mg/L、125mg/L、135mg/L、200mg/L、270mg/L五个浓度梯度的Basta水溶液，用棉球分别涂抹步骤二获得的36株转CBF1基因T0代黑麦草植株和步骤二获得的62株转DREB1B基因的T0代黑麦草植株叶片两面，8-10天后观察结果。结果如表1所示，对照(50株未转基因植株)对五个浓度的除草剂均表现为不抗(图10中图片a)，叶片枯黄或枯死；而转基因植株最高可抗135mg/L-200mg/L或更高(图10中图片b)，除270mg/L处理的叶片变黄外，其它浓度处理的叶片仍为绿色。图10中，数值表示对叶片进行处理的Basta水溶液的浓度。
表1.抗不同浓度Basta的转基因黑麦草株数(株) 六、转基因植株的抗旱效果鉴定一个黑麦草品种能否抗旱，抗旱程度多大，虽然在相关生理指标可以进行鉴定，但其是否真正具有抗旱性，仍需要通过实际的检验。采用室内(室温不高于26℃)模拟干旱条件的方法，27株T0代转pBAC122植株，7株T0代转pBAC123植株，4株T0代转pBAC127植株，8株T0代转pBAC128植株，和4株未转基因对照，在幼苗时期(一次性浇足50ml水)停止浇水25天，然后恢复浇水。经过25天的人工温室的干旱处理，有9棵转基因植株显示了存活迹象(植株中心叶片的下部依然保持绿色，其余叶片萎蔫或顶部有些干枯)，而全部对照植株叶片则失绿、枯干。复水后，有4棵转基因植株123-21(转pBAC123植株，图11a)，128-14(转pBAC128植株)，122-7(转pBAC122植株，图11b)和128-24(转pBAC128植株)恢复生长，而全部对照植株死亡。图11a和图11b中的右侧盆中的植株均为未转基因植株对照，左侧盆中的植株均为转基因植株。说明与非转基因的对照相比部分转基因株系具有较强的抗旱性。
最终筛选出了4个抗旱效果较为显著的转基因黑麦草株系123-21(转pBAC123植株)，128-14(转pBAC128植株)，122-7(转pBAC122植株)和128-24(转pBAC128植株)。其中，128-14的正常生长植株照片如图12。
序列表<160>3<210>1<211>727<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ggatcctgat caatgaactc attttcagct ttttctgaaa tgtttggctc cgattacgag 60cctcaaggcg gagattattg tccgacgttg gccacgagtt gtccgaagaa accggcgggc120cgtaagaagt ttcgtgagac tcgtcaccca atttacagag gagttcgtca aagaaactcc180ggtaagtggg tttctgaagt gagagagcca aacaagaaaa ccaggatttg gctcgggact240ttccaaaccg ctgagatggc agctcgtgct cacgacgtcg ctgcattagc cctccgtggc300cgatcagcat gtctcaactt cgctgactcg gcttggcggc tacgaatccc ggagtcaaca360tgcgccaagg atatccaaaa agcggctgct gaagcggcgt tggcttttca agatgagacg420tgtgatacga cgaccacgga tcatggcctg gacatggagg agacgatggt ggaagctatt480tatacaccgg aacagagcga aggtgcgttt tatatggatg aggagacaat gtttgggatg540ccgactttgt tggataatat ggctgaaggc atgcttttac cgccgccgtc tgttcaatgg600aatcataatt atgacggcga aggagatggt gacgtgtcgc tttggagtta ctaatattcg660atagtcgttt ccatttttgt actatagttt gaaaatattc tagttccttt ttttagaatg720ggagctc 727<210>2<211>669<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2ggatcccaac tgatggacac cgccgctgcc ggctccccgc gtgaggggca caggacggtg 60tgctcggagc cgcccaagag gccggcaggg cggaccaagt tcagggagac gcgccacccg120ctgtaccgcg gcgtgcggcg ccggggccgg ctcgggcagt gggtgtgcga ggttcgcgtg180cgcggcgcgc aagggtacag gctctggctc ggcaccttca ccactgccga gatggcggcg240cgcgcgcacg actccgccgt gctcgcgctc ctcgaccgcg ccgcctgcct caacttcgcc300gactccgcct ggcggatgct gcccgtcctc gcggctggct cgtcccgctt cagcagcgcg360cgggagatca aggacgccgt cgccatcgcc gtcctggagt tccagcggca gcgccccgtc420gtgtcgacgt cggagatgca cgacggcgaa aaggacgccc aaggctcgcc gacgccgagc480gagctgtcca cgtccagcga cttgttggac gagcactggt ttggcggcat ggacgccggc540tcgtactacg cgagcttggc gcaggggatg ctcatggagc cgccgtccgc cagaacgtgg600agcgaggatg gcggcgaata cagcgccgtc tacacgccgc tttggaacta attatccgac660taagagctc669<210>3<211>1706<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3aagcttcatt ttctgctaca gaagtgttgt tctctgtaaa gtaatcagaa ggaatgtaat 60caacagaata aatctgctct tgaatgtcct ttgagttctg caggataata tctgacccct120catatttaac ctgcaataag aagactagct aaaatcagat gatgccaaga acaggaacca180gctctaccac tctacagcaa aagcaaaaac tactgttgtg tgtgccaact aaaatcaact240cagggattta ccgggtcatt tttgatctct agaacttcag agaaacattg gagatgatcc300
tcactcgtgc ataagagctt gttctcctgt atatcaaaag atgctttatc tcgcaatgaa360aaagaaaaag ctgaactagt tcaattagta caatgcttac acagcttgag caataccatc420tcaaaatcca actctggagt ctccaactca ataattttag gtgtagcttt atccgcaatg480gatctccgtc atccttcttc gaatagatca taacttcggt tttcaactcg gtattcgctt540aagcaccaaa atttccaacc caagtatgaa tataagatct aagcaacaat cagaaatgga600aactgagaaa acacaccaca aatttcgaaa aatctacaac caatctcact ataagaaaca660aaggaccgtt gacagaaaca gtcagcgaga ctcaggaaat tcgaaatttc acctccagga720actgataata tctagatcga aggaacttta cctcgtctga gtaataaact ccgagcgaag780agtcgtcgat ttcaaaaact cgatagtcca cactgacgcg gtcgggaacc acgtcggaaa840ggaacttcga caaagcagct tcaataggca aatttccgat agggatacta acattttcga900tcgagccaaa tcggagacgg tcttcttctc cgttgtagac gatgggtgcc gggaaattat960caggagccgg aagattgagg aagcctaggg tttcaaatac gtgagaaggt ggagtagaga1020agtaatcgat gttgagacat cgagttcgca tcgtaatttt ctagatccgt cttgggagct1080cagactgtat cagtgatgat gatgatgatg aagaagagaa cgaattttga aattggcggt1140tttgaatttt taagaaatta aaaaatatcc cccgtcgatt tcaagaggga gatggagata1200ccaaagcaac tctcgccact tgtcgtcttt taattttaat tgagtacgtt atgccgtttt1260aaatgttcaa aacagcacac agttgatagc tgaattgatt ttttcttttg ccgttttgtt1320atatttaaac aacacacagt gcatttgcca aataactaca tgatgggcca ataaacgtgg1380accgactaaa actaaataat agaagataca tcgataggct tctctaaaga tcggataaaa1440gataatgtcg catagccacg tagagagcaa ctggctgaga cgtggcagga cgaaacggac1500gcatcgtacg tgtcagaatc ctacagaagt aaagagacag aagccagaga gaggtggttc1560ggccatatgt catcgttctc tctataaact ttatggaact ttgttctgat tttctcagag1620acacgaaaag aaagaaaaca acactagaac aaagagggtt tgattgattc acttgaaaaa1680gagaaaacac agctttggaa ggatcc 170权利要求
1.培育抗旱性增强的黑麦草的方法，是将DREB转录因子的编码基因插入植物表达载体，得到含有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入黑麦草中，得到抗旱性增强的黑麦草。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述DREB转录因子的编码基因来源于拟南芥菜或小麦或水稻或玉米或大豆或油菜。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述DREB转录因子的编码基因来源于拟南芥菜。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述DREB转录因子的编码基因为来源于拟南芥菜的DREB1B基因或为具有Genbank Access No.AB013816的自5′端第612至1320位碱基的DNA片段。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述CBF1转录因子的编码基因来源于小麦。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述CBF1转录因子的编码基来源于小麦的CBF1基因或拟南芥菜或水稻。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述CBF1转录因子的编码基因为来源于小麦的CBF1基因或为具有Genbank Access No.AF376136的自5′端第8至657位碱基的DNA片段。
8.根据权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于在所述重组表达载体中，启动所述DREB转录因子的编码基因转录的启动子是拟南芥菜亲水蛋白RD29B基因的启动子或RD29A启动子或SAG12启动子或玉米Ubi启动子或CaMV 35S启动子。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述拟南芥菜亲水蛋白RD29B基因的启动子具有Genbank Access No.D013044的自5′端第85至1784位碱基的DNA片段。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述含有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体为pBAC122或pBAC123或pBAC127或pBAC128；所述黑麦草为多年生黑麦草和一年生黑麦草；所述黑麦草优选为多年生黑麦草，尤其优选为多年生黑麦草神枪手品种。
全文摘要
本发明公开了一种培育抗旱性增强的黑麦草的方法。本发明所提供的培育抗旱性增强的黑麦草的方法，是将DREB转录因子的编码基因插入植物表达载体，得到含有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入黑麦草中，得到抗旱性增强的黑麦草。本发明利用逆境诱导型启动子(RD29B)来增强外源DREB1B、CBF1基因的表达，能显著改良黑麦草的抗旱能力。
文档编号C12N15/63GK1762200SQ200510104869
公开日2006年4月26日 申请日期2005年9月23日 优先权日2005年9月23日
发明者张晓东, 杨凤萍, 梁荣奇, 张立全, 陈绪清, 孙振元 申请人:北京市农林科学院