专利名称：一种黑麦1rs染色体特异的est-sts标记引物2、筛选方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2、 筛选方法及用途，属于基因分子标记研究领域。
技术背景小麦是世界上重要的粮食作物之一，在生产中常常受到各种病害 的威胁，造成产量或品质的下降。小麦的近缘物种黑麦，具有抗病、 高产、耐瘠等许多优良性状。研究表明黑麦1RS染色体上有抗白粉 病、抗条锈病、抗叶锈病、抗杆锈病、抗麦二叉蚜等众多抗性基因， 还有提高产量和适应性的基因。通过远缘杂交和染色体操作技术，可 将黑麦1RS染色体上的这些有益基因导入至普通小麦。黑麦1RS染色体或染色体片段导入普通小麦后，需要对其迸行 鉴定，才可有效利用1RS上的外源优异基因。建立在DNA序列基础 上的分子标记，特别是以PCR为基础的分子标记，以其准确、快捷、 不受植物生长时期限制等优点而被广泛运用。Ko Jong-Min等筛选出 了两个黑麦基因组特异的RAPD (Random amplified polymo卬hic DNA,随机扩增的多态性DNA)标记，并获得了两个克隆pSclOC和 pSc20H,原位杂交结果显示它们分布于所有黑麦染色体上(参考文 南犬Jong-Min Ko, Geum-Sook Do， Duck画Yong Suh， et al. 2002. Identification and chromosomal orgnization of two rye genome-specifiRAPD products useflil as introgression markers in wheat. Genome, 45:157-164)。然而RAPD标记稳定性较差，难以在育种中有效利用。 M.Cristina Katto等根据pSc20H克隆设计了可以鉴定黑麦染色体片段 的以PCR为基础的标记(参考文献M.Cristina Katto， Takashi R. Endo,Shuhei Nasuda. 2004. A PCR-based marker for targeting for small rye segments in wheat background. Genes Genet. Syst" 79.p. 245-250)。刘成等筛选到黑麦特异的RAPD标记，并将其转化为SCAR标记(参考 文献刘成，李光蓉，杨足君，冯娟，周建平，任正隆.2006.黑麦基因 组特异DNA片段的分离与SCAR标记的建立.西北植物学报,26(12): 2434-2438)。然而这些标记对黑麦全基因组均有扩增，不是1R或IRS染色体特异的，从而无法将黑麦的1R染色体与2R 7R染色体区分 开。Koebner等根据黑麦与小麦rRNA基因间隔区序列差异，合成了 黑麦IR染色体特异引物NOR-Rl，可以鉴定1RS染色体，但对不含 有1R染色体上核仁组织区的重组材料用引物NOR-R1将无法鉴定 (参考文南犬Koebner R. M. D. 1995. Generation of PCR-based markers for the detection of rye chromatin in wheat background. Theor Appl Genet, 90: 740-745)。EST (expressed sequence tag,表达序列标签)是指从不同组织来 源的cDNA文库中随机挑选克隆，并对其3'端或5'端迸行单轮测序 所获得的短cDNA序列(参考文献Adams M D， Kelley J M， Gocayne J D, Dubnick M， Polymeropoulos M H. 1991. Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project. Science:252:1651-1656)。由于EST标记直接来源于cDNA,其保守性较高， 特别是在亲缘物种之间具有相对的保守性，所以根据EST所开发的 STS标记(Site tagged sequence,位点标签序列，即直接在EST序列 两端设廿引物)在物种之间具有较好的通用性(参考文献:LaRotaM, Sorrells M E. 2004. Comparative DNA sequence analysis of mapped wheat ESTs reveals the complexity of genome relationships between wheat and rice. Funct Integr Genomics, 4: 34~46)。比较基因组学石开究 表明普通小麦及其近缘物种之间存在共线性，因此可以利用小麦上已 开发的EST序列来研究小麦的亲缘物种。 发明内容本发明利用黑麦属与小麦属(7H"c)同属于小麦亚族 (7h力'"Vwe)，理论上它们具有较高的共线性关系，定位于小麦第一部 分同源群上的EST序列很可能也存在于黑麦1R染色体的相应部位， 因此设廿以PCR为基础的标记，转化成STS引物，筛选黑麦IRS染 色体特异的分子标记，以快速检测和追踪导入普通小麦背景中的黑麦 IRS染色体。本发明的技术方案是通过如下手段实现的这种黑麦IRS染色 体特异的EST-STS标记引物2，其特征在于该标记引物是根据小麦 第一部分同源群的EST序列一 BE443401为模板设廿而得到的，其 序列为STS, : F: 5，- GCATCTGCCAACACTCTCAA - 3，，
R: 5 ，- ACGGCAGCATGTAGAGACAA - 3' 。所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2，其特征在于 引物STS目扩增出的两条大小为1680bp和1750bp的特异片段位于 黑麦1RS染色体上。所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2的筛选方法， 其特征包括如下步骤a、 引物的设计与合成根据小麦第一部分同源群的EST序列， 选取35个碱基数大于300bp的EST序列进行下载，利用Primer Premier5.0软件设廿了35对引物，条件为退火溫度50-60°C,引物的 长度18-22bp, GC。/o含量为40-60%，预期扩增产物300-600bp ;合成 的引物用超纯水溶解至20^imolL-l作为母液于-20。C冰箱保存，使用 前吸取部分母液用10mM Tris - HC1与lmM EDTA稀释至2pmo1 /L 作为工作液待用；b、 黑麦染色体特异标记引物的筛选利用步骤a设计合成的35 对EST-STS引物，分别对普通小麦中国春；小麦近缘物种帝国黑麦、 簇毛麦、大麦和鹅观草的基因组DNA进行多态性扩增分析，结果引 物STSWE3(序列为STSwe3F: 5，- GCATCTGCCAACACTCTCAA- 3， 和STSwe3R: 5，- ACGGCAGCATGTAGAGACAA - 3，)在帝国黑麦中 扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，从而筛选出黑麦染色体组 特异的EST-STS标记引物；c、 黑麦1R染色体特异标记引物的筛选利用步骤b中筛选到的
多态性EST-STS引物，分别对普通小麦中国舂和一整套中国春-帝国黑麦的二体附加系进行扩增分析，结果在帝国黑麦与中国春-帝国黑 麦1R二体异附加系中分别扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，确定黑麦1R染色体特异标记引物；d、黑麦1RS染色体特异标记引物的筛选利用步骤b中筛选到 的多态性EST-STS引物，分别对普通小麦小偃6号、帝国黑麦、普 通小麦铭贤169和小麦/黑麦1BL/1RS易位系洛夫林10、洛夫林13 进行扩增分析，结果洛夫林10、洛夫林13和帝国黑麦能扩增大小为 1680bp和1750bp的特异带，确定黑麦1RS染色体特异标记引物STSwE3 °所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物的筛选方法，步骤b 所述扩增分析包括在体积为0.2mL的Eppendof管中依次加入约 10 20ng的模板DNA, 1xPCR buffer, 1.5mmol I/1 MgCl2, 200mmol L-1 dNTP，左右引物终浓度各为0.2^imo1 L'1, 0.5U Taq DNA聚合酶，最 后用无菌蒸馏水补充反应体系至10liL ;然后将有上述反应液的 Eppendofl放置在PE2700基因扩增仪上迸行扩增反应；扩增反应程序 为先94。C预变性3分；再94。C变性30秒，55。C退火30秒，72。C延伸l 分20秒，循环32次；72。C延伸10分；最后1(TC保存；扩增反应结束后对PCR扩增产物进行电泳检测，結果引物STSwe3 在帝国黑麦中扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，而无黑麦基因组的中国春、大麦、簇毛麦和鹅观草没有扩增出这两条带,确定STSwE3就是黑麦染色体组特异的标记。 所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2的筛选方法，所述 PCR扩增产物逬行电泳检测步骤为在PCR扩增产物中加入指示剤 2 )iL,混匀，取其中3 ^用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电 泳电压为150 180 V，电泳1.5h后，用银染法迸行染色，最后将染色 后的胶在凝胶成像仪上观测照相。所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2的用途，其特 征在于使用标记引物扩增分析1RS易位材料，能够同吋扩增出两 条大小为1680bp和1750bp特异带的材料，即可确定含有黑麦1RS 染色体。本发明与已有技术相比较的优点是1 、本发明的黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物不仅拓宽 了小麦EST的使用范围，同吋为深入研究普通小麦远缘杂种材料提 供了新的工具。2、本发明的黑麦1RS染色体特舁的EST-STS标记引物利用普通 PCR技术就可以进行，不需要其他繁琐的程序，可以简单、快速地鉴 定黑麦1RS染色体。3 、本发明的黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物与模板的 结合能力较强，虽然本研究所使用的退火温度为55°C,但退火温度 在51-58。C均能较好地扩增出目标片段，实验条件要求比较宽松。4 、本发明的黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物序列位于 小麦IBS染色体中部区域，根据比较基因组学的原理，该标记也应
该位于1RS染色体中部区域，因此可以结合其它1RS染色体的特异标记鉴定涉及IRS不同断点的材料。
图1 : BE443401的序列以及本发明STSWE3的正向引物和反向引 物的反向互补序列在EST序列上的位置。图2 :用本发明设廿合成的35对EST-STS引物分别对普通小麦中国春；小麦近缘物种帝国黑麦、簇毛麦、大麦和鹅观草的基因组 DNA进行多态性扩增分析，结果只有引物STSwE3在帝国黑麦中扩增 出大小为1680bp和1750bp的带，而中国春、大麦、簇毛麦和鹅观草没有扩增出这两条带，说明STSwE3是黑麦染色体组特异的标记。图3 :用普通小麦中国舂、帝国黑麦及一整套中国舂-帝国黑麦 1R 7R 二体异附加系共9个材料的DNA为模板，用本发明的引物 STSwE3进行PCR扩增，结果显示只有附加1R染色体的材料能扩增 出与帝国黑麦一样的大小为1680bp和1750bp的特异带，而对照中国 春和2R 7R异附加系没有扩增出这两条特异带，说明这两条带位于 黑麦1R染色体上。图4 :用普通小麦小偃6号、帝国黑麦、普通小麦铭贤169、小 麦/黑麦1BL/1RS易位系洛夫林10和洛夫林13共5个材料的DNA 为模板，用本发明的引物STSwE3迸行PCR扩增，结果显示只有洛夫 林10和洛夫林13能扩增出与帝国黑麦一样的大小为1680bp和 1750bp的特异带，说明这两条带位于黑麦1RS染色体上。
图5 :用普通小麦小偃6号与"德国白粒"黑麦杂交后代选育的11个材料的DNA为模板，用本发明的引物STSwE3迸行PCR扩增， 其中4个含有1RS染色体的后代材料均扩增出1680bp和1750bp的特异带,7个不含有黑麦1RS染色体的材料没有扩增出相应的特异带。 图示1 11为小偃6号与"德国白粒"黑麦杂交后代材料，M为分子 量标记DL2000 。
具体实施方式
实施例l 、引物的设廿与筛选1 、 EST序列的获得根据美国农业部网站 (http:〃wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml )发布的小麦表达序列标 签(EST)数据库，查找定位于小麦第一部分同源群不同物理区段的 EST及其序列，选取35个保守性比较强的且碱基数大于300bp的EST 序列进行下载。附图1是其中一个EST —BE443401的碱基序列。2、引物的设廿与合成将步骤1中下载的EST序列，利用Primer Premier 5.0软件对其进行引物的设廿，共设廿了35对引物。引物设 廿的条件为退火温度50-60°C，引物的长度18-22bp， GCy。含量(鸟 嘌Guanine和胞嘧啶Cytosine占碱基总数的比例)为40-60%,预期 扩增产物300-600bp。设廿的引物由上海联合基因有限公司合成。3 、引物的稀释将步骤2中合成的引物，用超纯水溶解至20|_imol L"作为母液于-20。C冰箱保存，使用前吸取部分母液用lxT.E (10mM Tris-HCl与ImM EDTA PH = 8.0)稀释至2pmo1 L'1作为工作液待用。4、黑麦特异标记的筛选如果某个引物在黑麦中扩增出与其他供试材料有差异的带，那么这个引物就是筛选出的黑麦染色体组的特 异的引物。利用步骤3中稀释好的35对EST-STS引物，分别对普通小麦中 国春；小麦近缘物种帝国黑麦、簇毛麦、大麦和鹅观草的基因组DNA 进行多态性扩增分析，具体扩增如下在体积为0.2mL的Eppendof 管中依次加入约10 20ng的模板DNA, lxPCR buffer, 1.5mmol L" MgCl2，200mmol I/1 dNTP,左右引物终浓度各为0.2^mol L",0.5U &《 DNA聚合酶，最后用无菌蒸馏水补充反应体系至10pL。然后将有上 述反应液的Eppendof管放置在PE2700基因扩增仪上进行扩增反应。 扩增反应程序为先94。C预变性3分；再94。C变性30秒，55。C退火 30秒，72。C延伸1分20秒，循环32次；72。C延伸10分；最后10°C 保存。PCR扩增产物检测方法为在PCR扩增产物中加入指示剤 (0.25%溴酚蓝、0.25%甲基绿、40%蔗糖，水余量)2jiL，混匀，取 其中3 jiL用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(聚丙烯酰胺N,N'-甲叉双 丙烯酰胺=39:1)电泳检测，电泳电压为150-180 V,电泳1.5 h左 右后，用银染法进行染色，最后将染色后的胶在凝胶成像仪上观测照 相。结果引物 STSWE3 (序列为STSWE3F: 5，-GCATCTGCCAACACTCTCAA - 3，禾0 STS鶴R: 5，-ACGGCAGCATGTAGAGACAA - 3')在帝国黑麦中扩增出大小为 1680bp和1750bp的带，而中国春、大麦、簇毛麦和鹅观草没有扩增
出这两条带，如图2所示，说明STSwE3就是黑麦染色体组特异的标 记引物。
5 、黑麦1RS染色体特异标记的筛选
利用步骤4筛选到的多态性EST-STS引物STSWE3，对中国舂和 一整套中国春-帝国黑麦的二体异附加系(公知公用，参考文献: Driscoll C J, Sears E R, 1971. Individual additions of the chromosomes of "Imperial" rye to wheat. Agron Abstr， 1971:6)进行PCR扩增反应， 反应条件与扩增程序同步骤4 。 PCR扩增反应后对扩增产物进行电泳 检测，检测方法同步骤4，检测后确定引物STSwe3在帝国黒麦及中 国舂-帝国黑麦1R 二体异附加系中分别扩增出大小为1680bp和 1750bp的特异带，而对照中国舂与中国春-帝国黑麦2R m 二体异附 加系均没有扩增出这两条相应的特异带，如图3所示，说明这个标记 为黑麦1R染色体特异标记。
然后利用引物STSwE3扩增普通小麦小偃6号、帝国黑麦、普通 小麦铭贤169、小麦/黑麦1BL/1RS易位系洛夫林IO和洛夫林13，反 应条件与扩增程序同步骤4 。PCR扩增反应后对扩增产物用进行电泳 检测，检测方法同步骤4 ,结果显示只有1BL/1RS易位系洛夫林10、 1BL/1RS易位系洛夫林13和帝国黑麦能扩增出大小为1680bp和 1750bp的特异带，如图4所示，说明这两个扩增位点位于黑麦1RS 染色体上，引物STSwe3为黑麦1RS染色体的特异标记。因其扩增出 两条特异带，故命名为黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2。
实施例2、本发明的标记引物在1RS易位材料中的检测应用
利用实施例1中筛选到的黑麦1RS染色体特异的标记引物 STSWE3,扩增小偃6号和::德国白粒二黑麦OS. cewa/e丄.cv gerwa"
杂交的部分后代材料，反应条件与扩增程序同步骤4 ,扩增反应后对 扩增产物进行检测，检测方法同步骤4 ,结果在供试的ll个材料中， 4个材料扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，即可确定含有黑 麦1RS染色体。其它7个材料没有扩增出这两条相应的特异带，即 可确定其不含有黑麦1RS染色体，如图5所示。此结果与基因组原 位杂交鉴定结果一致。
本发明列举的实施旨在更进一步地阐明这种黑麦1RS染色体特 异的EST-STS标记引物、筛选方法及用途。而不对本发明的范围构 成任何限制。
权利要求
1.一种黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2，其特征在于该标记引物是根据小麦第一部分同源群的EST序列-BE443401为模板设计而得到的，其序列为STSWE3F5’-GCATCTGCCAACACTCTCAA-3’，R5’-ACGGCAGCATGTAGAGACAA-3’。
2 、根据权利要求1所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引 物，其特征在于引物STSwE3扩增出两条的大小为1680bp和1750bp 的特异片段位于黑麦1RS染色体上。
3 、根据权利要求1所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引 物2的筛选方法，其特征包括如下步骤a、 引物的设计与合成根据小麦第一部分同源群的EST序列， 选取35个碱基数大于300bp的EST序列进行下载，利用Primer Premier5.0软件设廿了35对引物，条件为退火温度50-6CTC ,引物的 长度18-22bp， GC。/。含量为40-60%,预期扩增产物300-600bp ;合成 的引物用超纯水溶解至20nmolL-l作为母液于-2(TC冰箱中保存，使 用前吸取部分母液用10mM Tris - HC1与imM EDTA稀释到2pmo1 /L 作为工作液待用；b、 黑麦染色体特异标记引物的筛选利用步骤a设计合成的35 对EST-STS引物，分别对普通小麦中国舂；小麦近缘物种帝国黑麦、簇毛麦、大麦和鹅观草的基因组DNA进行多态性扩增分析，结果引 物STSWE3 (序列为STSWE3F: 5，- GCATCTGCCAACACTCTCAA-3，和STSwe3R: 5，-ACGGCAGCATGTAGAGACAA - 3，)在帝国黑 麦中扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，从而筛选出黑麦染色 体组特舁的EST-STS标记引物；c、 黑麦1R染色体特异标记引物的筛选利用步骤b中筛选到的 多态性EST-STS引物，分别对中国舂和一整套中国春-帝国黑麦的二 体附加系进行扩增分析，结果在帝国黑麦及中国舂-帝国黑麦1R二体 异附加系中分别扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，确定黑麦 1R染色体特异标记引物；d、 黑麦1RS染色体特异标记引物的筛选利用步骤b中筛选到 的多态性EST-STS引物，分别对普通小麦小偃6号、帝国黑麦、普 通小麦铭贤169和小麦/黑麦1BL/1RS易位系洛夫林10、洛夫林13 进行扩增分析，结果洛夫林10、洛夫林13和帝国黑麦能扩增出大小 为1680bp和1750bp的特异带，确定黑麦1RS染色体特异标记引物STSwE3 。
4 、根据权利要求1所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2 的筛选方法，其特征在于步骤b所述扩增分析包括在体积为0.2mL 的Eppendof管中依次加入约10 20ng的模板DNA, 1 xPCR buffer, 1.5mmolL"MgCl2， 200mmol L'1 dNTP,左右引物终浓度各为0.2fimo1 L/1, 0.5UTaqDNA聚合酶，最后用无菌蒸馏水补充反应体系至10nL ; 然后将有上述反应液的Eppendom放置在PE2700基因扩增仪上迸行扩增反应；扩增反应程序为先94'C预变性3分；再9fC变性30秒， 55。C退火30秒，72。C延伸l分20秒，循环32次；72。C延伸10分；最后 IO'C保存；扩增反应结束后对PCR扩增产物进行电泳检测，结果引物STSwE3 在帝国黑麦中扩增出大小为1680bp和1750bp的特异带，而无黑麦基因组的中国春、大麦、簇毛麦和鹅观草没有扩增出这两条带，确定STSwE3就是黑麦染色体组特异的标记。
5、 根据权利要求4所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2的筛选方法，其特征在于所述PCR扩增产物进行电泳检测步骤为 在PCR扩增产物中加入指示齐U2jiL，混匀，取其中3^用8%非变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150 180 V，电泳1.5h后，用 银染法进行染色，最后将染色后的胶于凝胶成像仪上观测照相。
6、 根据杈利要求1所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引 物2的用途，其特征在于使用标记引物扩增分析1RS易位材料， 能够同时扩增出两条大小为1680bp和1750bp特异带的材料，即可确 定含有黑麦1RS染色体。
全文摘要
本发明提供一种黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物2，其特征在于该标记引物是根据小麦第一部分同源群的EST序列一BE443401为模板设计而得到的，其序列为STS<sub>WE3</sub>F5’-GCATCTGCCAACACTCTCAA-3’，STS<sub>WE3</sub>R5’-ACGGCAGCATGTAGAGACAA-3’。引物STS<sub>WE3</sub>扩增出的两条大小为1680bp和1750bp的特异片段位于黑麦1RS染色体上。本发明的标记引物不仅拓宽了小麦EST的使用范围，同时为深人研究普通小麦远缘杂种材料提供了新的工具，利用普通PCR技术就可以进行，不需要其他繁琐的程序，可以简单、快速地鉴定黑麦1RS染色体。
文档编号C12Q1/68GK101165194SQ200710139509
公开日2008年4月23日 申请日期2007年9月28日 优先权日2007年9月28日
发明者安调过, 王春梅, 强 高 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所