专利名称：：多年生黑麦草上三种腥黑粉菌近似种的检测方法
技术领域：
：本发明涉及使用PCR技术检测寄生于禾本科草种多年生黑麦草(Z^'画网re朋eL.)上小麦矮腥黑穗菌(37〃油'aco"的w^aKtihn,TCK)、黑麦草腥黑粉菌(T./。〃,')和r.v朋y^'的方法，属于禾本科草种腥黑粉菌检测领域。技术背景多年生黑麦草(ZoZ/wm/^rem^L.)是世界上最重要的禾本科栽培牧草之一，原产于欧洲，1972年开始引入我国，已成为我国春秋季节主要的栽培牧草，广泛栽培于我国各地。多年生黑麦草属冷季型丛生禾草，具有旺盛的幼苗活力，生活力强；抗病抗逆性强，能够抵抗多种病虫害，耐旱，耐高温；营养生长期长，分蘖多，形成茂盛的草丛，伺料质量佳。该牧草成功地解决了我国畜牧业冬春季节青绿饲料不足的弊端，生长快、成熟早、效益高且稳定。多年生黑麦草也是一种优良的草坪草，叶色深绿，生长低矮，具快速的草坪建植特性，耐低修剪，耐践踏，适于草坪建植。草坪建植过程中，常与旱地早熟禾、高羊茅等草种混合栽培，用作绿化材料。同时多年生黑麦草能抗二氧化硫等有害气体，起到净化空气的作用(王栋原著，任继周等修订.牧草学各论，新一版，江苏科学技术出版社，1989,153-154.)。腥黑粉菌是黑麦草上非常重要的真菌病害，巳经成为黑麦草生产的严重威胁，致使草坪景观受到破坏，产量和品质严重降低甚至死亡(赵美琦，孙明，王慧敏，王琦主编.草坪病害,中国林业出版社，1999,230-232.)。根据Lindeberg(LindebergB.1959.UstilaginalesofSweden.t^wa/.16:67-75.)、Duran&Fischer(DuranR,FischerGW.1961.TheGenus7)7/e"<x/W/腿w船流"gtow5>她L/w'vem'(y尸潛&)、Vlnky(Vdnky.1994.Europeansmutfungi.GustavFisherVerlag;Stuttgart.)禾口Mordue(MordueJE.1984.D'〃e"fl/o/z)'.CM/Destr/;^o形/，*"m/6""m'",804.)的研究，寄生于黑麦草的腥黑粉菌有两种，即小麦矮腥黑穗菌TCK和黑麦草腥黑粉菌7:/o///。1999年Castlebury和Carris从形态学、细胞学、分子生物学多方面进行研究，将从多年生黑麦草中发现的一种与小麦印腥黑粉菌(T^miia)相似的腥黑粉菌定名为新种黑麦草粒腥黑粉菌(r.而/fe")(Castlebury,LA&CarrisLM.1999.77〃e/iaHY/Aer/,anewspecieson丄o/z'w附mw/ny/orwmand丄.Afyco/og/a，91:121-131.)。2002年、2003年、2005年天津出入境检验检疫局在来自澳大利亚和德国的多年生黑麦草中发现一种担孢子无"H"结合的腥黑粉菌，冬孢子形态与TCK及r6raw/非常相似，于2007年和美国黑粉菌专家LoriCarris、LisaCastlebury共同发表新种r.v朋A^'(CarrisLM,CastleburyLA,GuomingHuang,a/.Tif//eriava"^y/,anewspeciesofreticulate-sporedbuntfunguswithnon-conjugatingbasidiosporesinfectingspeciesofFeWwcaand丄o/Zww.A^>co/og/ca/iesearc/z2007，111(12):1386-1398.)。至此，寄生在黑麦草上的腥黑粉菌共发现四种，它们是TCK、r.亂r.wfl/teh和r.wmAy/，其中r.而/fen'冬孢子具疣状突起，与其他三种黑粉菌易于区分，tck、r./0///、r.ra"w冬孢子胞壁纹饰均为网状，从形态上难以鉴定区分[章正.关于小麦矮腥病菌某些近似种的探讨.植物病理学报，1980,10:89-94;章正，章桂明，朱连.黑麦草粒腥黑粉病菌与黑麦草的检疫问题.植物检疫，2005,19(6):362-367;IngoldCT.Thebasidiumof77〃幼》andit，sevolution.A^co/og/W,1997,11(3》98-100.]。腥黑粉菌属主要依据形态学、萌发生理、细胞学诸方面的特性以及寄主专一性这些传统方法进行分类。腥黑粉菌冬孢子萌发生理差异可以作为区分鉴定的依据之一(罗加凤，黄国明，崔铁军，刘跃庭，廖芳.中华人民共和国国家出入境检验检疫行业标准一禾草腥黑穗病菌、剪股颖腥黑穗病菌、黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法，SN/T1812-2006.)，但萌发是否成功受材料保存时间、材料来源、培养条件等诸多因素的制约，而且TCK培养时间最长达三个月，不适宜于口岸的快速检疫，TCK作为我国对外颁布的重要检疫性有害生物，一直是我国进境麦类和禾本科草种病害检疫的中心问题，r./0//z、r.ww^r主要在美洲、欧洲和大洋洲发生，目前在我国尚无发生，快速准确地区分这三种腥黑粉菌对口岸进境草种检疫具有十分重要的意义。目前尚未有黑麦草上TCK、r./0///、r.wm^y/分子检测方法的报道。近年来随着分子生物学技术的飞速发展，分子生物学方法在腥黑粉菌的检测鉴定上得到了广泛的应用，诸如PCR、实时荧光PCR、RAPD、RFLP、AFLP，以及基因序列分析方法等，用到的基因序列包括ITS、IGS、mtDNA、延长因子基因、微管蛋白基因、肌动蛋白基因、细胞色素氧化酶基因、黑色素合成酶基因、交配型基因和磷酸甘油酸合成酶基因等[高强，吴品珊，朱水芳等.实时荧光PCR技术对小麦矮腥黑穗病菌的检测.微生物学通报,2005,32(6):74-77]。尤其是在印度腥黑粉菌和近似种T.w"/fen'的检测鉴定上，许多人作了大量研究，确立了新种r.w"/fen'，解决了困扰小麦和草种的国际贸易难题[程颖惠，章桂明，王颖等.小麦印度腥黑穗病PCR检测.植物检疫，2001,15(6):321-325;CastleburyLA,CardsLM.7H/"/a丽/fe"—,anewspecieson丄0//"附附"^;/70^附肌(1￡.;^^朋￡.显:^0/(^/"，1999,91(1):121-131;易建平，陶庭典，沈禹飞等.进境黑麦草种子中黑麦草腥黑粉菌的鉴定.南京农业大学学报,2002,25(2):52-56.]。近年来，随着我国农牧业以及城市扩大草坪绿地美化环境的需要，境外的草种大量引入，作为优良的牧草和草坪草，多年生黑麦草作为重要经济价值的栽培品种被大量引进，并在各地广泛栽培。随着草业国际化引种频繁，tck、r./o肌、；r.v""^,'通过口岸传入我国的风险越来越大。腥黑粉菌的检疫鉴定是该草种真菌检疫的重要工作之一，为了保护我国的牧草生产和城市绿化，有必要在口岸建立小麦矮腥黑粉菌tck、r./o///和r.v朋^/的快速准确的分子检测方法。
发明内容针对上述情况，本发明建立了快速简便、特异性强、灵敏度高、准确可靠的黑麦草上小麦矮腥黑粉菌(77〃W"c朋加vera"Ktihn，简称TCK)、黑麦草腥黑粉菌(7:/o〃/)禾卩7:ra"^,'的三重PCR分子检测方法，并能将这这三种黑粉菌区别开来。该方法不仅能够检测菌丝基因组DNA，而且可以利用冬孢子三重套式扩增实现对三种腥黑粉菌冬孢子的检测，节约了试剂和时间，检测快速、可靠，整个过程在一个工作日内完成，可在口岸检测中推广应用。本发明中收集了7〃^a属的3种近似种共计ll个菌株(表l，菌丝和冬孢子)，来源于天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心植检实验室，LMC353、V767、LMC94、V21-711-l等为交流的冬孢子，其它的实验材料为本室近年所收集的冬孢子。其中LMC353、LMC94、Xia5、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l使用培养的菌丝体，不能培养出菌丝的V767和TCK2、TCK4、TCK7以及LMC353、LMC94、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-1等作为套式三重PCR检测方法中的冬孢子材料。供试材料的相关信息见表l。具体技术方案如下本发明目的是提供一种利用PCR引物对多年生黑麦草上的TCK、7:和7:iw^y/进行检测的方法，这些引物既可以对这三种腥黑粉菌进行检测，又可以将它们区分开来，引物的序列和用途如下(1)腥黑粉菌属(77//幼'a)通用引物，引物序列如下通用外套引物IGSUF1:GGATGCATTCTGGGGACGTIGSUR1:GTAGCCTTGTTGCTACGATCTG通用内套引物NIGSUF1:CACCGCCCAAGCACGTACNIGSUR1:GACCTTTTGGGGTCAAACTTCTC通用外套引物用于菌丝基因组DNA或冬孢子套式扩增，扩增片段约为900bp，通用内套引物用于冬孢子的套式扩增，扩增片段约为700bp，这两套引物用于TCK、I和Iv朋一的检测；(2)TCK、7:/o仿、rv朋^'各自的特异引物和7>朋一的外套引物，引物序列如下TCK的外套引物IGSUF1/IGSUR1TCK的特异引物LSKF:GAAGTTTCCTTCGCCLSKR:ACTTCTCTCGGAACATCACTGT特异引物的扩增片段约为800bp,这两套引物用于TCK的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增，7:/o〃/的外套引物IGSUF1/IGSUR17:/o〃/的特异引物LSLF:GGTGGACTGACATTCGTCLSLR:CGCATGTCCGTCGGACCG特异引物的扩增片段约为250bp，这两套引物用于7:/0///的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增，Iv""^y/外套引物unF:AACTGTATGGATCATCCAGAGCunR:GTAATGCCAGAGGATTGTCCT7:wmAyi特异引物LSNF:CTCTGTGAGGATATGCCALSNR:GAGAATAACTGTTGTATGATGCCA特异引物的扩增片段约为550bp，这两套引物用于Iraw^/的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增；TCK、Z/o///、rv""一三者的特异引物，用于菌丝基因组DNA三重特异性PCR扩增，特异性检测这三种菌丝体，各自的外套引物与特异引物的三重套式PCR扩增，用于特异性检测这三种真菌的冬孢子。本发明的另一个目的是检测多年生黑麦草上小麦矮腥黑穗菌和黑麦草腥黑粉菌的方法以及12条引物在检测这三种腥黑粉菌近似种方面提供应用。具体操作歩骤如下(1)实验材料冬孢子的萌发和菌丝的培养；(2)菌丝基因组DNA的提取；(3)冬孢子的挑取与破碎；(4)菌丝基因组DNA三重PCR检测方法的建立；(5)冬孢子三重套式PCR检测方法的建立。与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明建立了快速简便、特异性强、灵敏度高、准确可靠的黑麦草上TCK、r./o肌、T.ra^^三重PCR分子检测方法，能将黑麦草上腥黑粉菌近似种TCK、r.to肌、r.wmAyZ区别开来。采用通用引物实现对实验过程的检测，避免了假阴性。该方法不仅能够检测菌丝基因组DNA，而且可以利用冬孢子三重套式扩增实现对三种腥黑粉菌冬孢子的同时检测，节约了试剂和时间，检测快速、可靠，整个过程在一个工作R内完成，可有效在口岸检测中推广应用，特别是冬孢子三重套式扩增实现对TCK、r./o/"、r.wm^y/冬孢子的同时检测，为直接应用于国内外对黑麦草传带TCK、r./0///、r.v朋^y/的检测创造了技术条件。下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。图1:菌丝基因组DNA通用外套引物扩增和特异引物的三重扩增图2:冬孢子通用引物套式PCR扩增图3:冬孢子特异弓I物三重套式PCR扩增具体实施方式实施例l:实验材料冬孢子的萌发和菌丝的培养实验涉及的材料包括"7/^"属的3种近似种共计11个菌株(为菌丝和冬孢子)來源于天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心植检实验室，LMC353、V767、LMC94、V21-711-l等为交流的冬孢子，其它的实验材料为本室近年所收集的冬孢子，其中LMC353、LMC94、Xia5、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l使用培养的菌丝体，不能培养出菌丝的V767和TCK2、TCK4、TCK7以及LMC353、LMC94、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-1等作为套式三重PCR检测方法中的冬孢子材料。相关信息见表l。_表l供试材料_序号真菌名称#1H备注0.5mLEppendorf离心管中加入适量0.25%的次氯酸钠溶液，挑取一定数量的冬孢子放入，用涡旋振荡器混和，消毒50秒后，以3000转/分钟离心l分钟，立即用微量加样器吸去上清液，混和与离心处理时间不超过3分钟，加无菌水离心清洗两次，将冬孢子沉淀物转至3%琼脂平板上，在各自的最适温度下光照培养。培养20天的菌落，用无菌水冲洗至PDA(马铃薯培养基)上，继续培养30-45天后，收集大量菌丝供DNA提取。实施例2:菌丝基因组DNA的提取采用上海生工基因组DNA纯化试剂盒(编号SK1252)提取菌丝DNA。提取的基因组DNA溶于70pLlxTE中，其余菌丝置-70。C下备用。实施例3:冬孢子的挑取<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>菌菌菌冬冬冬菌菌菌菌冬载玻片上放置lmm见方的盖玻片，其上滴约0.5^L10xPCR缓冲液(10mmol/LTris-HCl,50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgCl2,pH8.3)，用解剖针剌破菌瘿，挑取3-10个左右冬孢子置10xPCR缓冲液中，盖上近似大小的盖玻片，用镊子轻轻摩擦盖玻片，显微镜下确认孢子破裂后将叠合的两片盖玻片一起放入含4.5pL10xPCR缓冲液的PCR管底部，盖上管盖，以不添加冬孢子仅含PCR缓冲液作为阴性对照。实施例4:菌丝基因组DNA三重PCR检测方法的建立PCR扩增试剂为大连宝生物(TaKaRa)工程公司产品。4.1菌丝基因组DNA通用引物的PCR扩增4丄1反应混合液的配制反应体系为20)aL:10x缓冲液2.0^L(其中含有终浓度为1.5mmol/L的MgCl2)，浓度各为2.5mmol/L的四种dNTP共0.化L，浓度为20pmol/L的引物(IGSUF1/IGSUR1)各为0.2pL，0.2pLTaqDNA聚合酶(5U/pL)，0.5pL模板DNA(约为40ng)，加无菌水至20pL，以阳性质粒作为阳性对照，以添加无菌水为模板作为阴性对照。4丄2PCR反应程序94'C预变性5分钟；94'C变性30秒，63"C复性30秒，72'C延伸1分钟，35个循环；72。C延伸7分钟。4丄3结果分析对7个菌株的菌丝基因组DNA进行属通用引物IGSUF1/IGSUR1的扩增，以阳性质粒作为阳性对照，以添加无菌水为模板作为阴性对照。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后均能观察到特定大小的目的带，外套通用引物扩增的片段应为900bp，阳性质控和所有的菌丝基因组DNA均能得到特定大小的目的片段，表明该通用引物可以用于三种腥黑粉菌菌丝体的检测。见图1。图1中的18个泳道从左到右分别用1、2、3、4、5、6、7、8、9、M、10、11、12、13、14、15、16、17表示。阴性对照无相应产物，见泳道18，其中1为阳性质粒，28分别为LMC353、LMC94、Xia5、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-1,9为阴性对照，M为2000bpDNA分子量标准。4.2菌丝基因组DNA特异引物的三重PCR扩增4.2.1反应混合液的配制多重PCR反应体系为20^L:10x缓冲液2.0i^L(其中含有终浓度为1.5mmol/L的MgCl2)，浓度各为2.5mmol/L的四种dNTP共0.5^L，浓度为20mmol/L的6条引物(LSKF/LSKR、LSLF/LSLR和LSNF/LSNR)各为0.2pL，0.2pLTaqDNA聚合酶(5U/pL)，0.5pL模板DNA(约为40ng)，加无菌水至2(VL，不设置阳性对照。94.2.2PCR反应程序94。C预变性5分钟；94t:变性20秒，6rC复性20秒，72。C延伸50秒，35个循环；72'C延伸7分钟。4.2.3结果分析对7个菌株的菌丝基因组DNA进行三对特异引物(LSKF/LSKR、LSLF/LSLR禾口LSNF/LSNR)的三重PCR扩增，以添加无菌水为模板作为阴性对照。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后均能观察到特定大小的目的带。TCK特异引物扩增的片段应为800bp，只有LMC353、Xia5和LMC94显示800bp的带(图1中10~12)。71.va"y^的扩增片段应为550bp，只有Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l显示550bp的目的带(图1中13~16)，阴性对照无相应产物(图1中17)，M为DNA分子量标准(2000bp,1000bp,750bp,500bp)。这一结果表明通过三重PCR扩增可以把TCK、Z/o"/和r.ra"/^/的菌丝体区别开来。实施例5:冬孢子三重套式PCR检测方法的建立5.1反应混合液的配制第一轮的反应体系为50pL:浓度各为2.5mmol/L的四种dNTPs共0.5pL，浓度为20pmol/L的引物(IGSUFl/IGSURl和unF/unR)每条各为0.5pL，0.5pLTaqDNA聚合酶(5U/pL)，模板和PCR缓冲液共5pL，加无菌水至50pL，采用阳性质粒作为阳性对照，只添加PCR缓冲液为阴性对照。第二轮的反应体系为20(iL:弓1物NIGSUF1/NIGSUR1的扩增反应体系同实施例4中的4丄1，模板为lpL第一轮扩增产物，设置阳性对照和阴性对照；引物LSKF/LSKR、LSLF/LSLR和LSNF/LSNR三重扩增的反应体系同实施例4中的4丄1，模板为1pL第一轮扩增产物，不设置阳性对照，设置阴性对照。5.2PCR反应程序第一轮PCR的反应程序为94。C预变性5分钟；94。C变性30秒，56'C复性30秒，72。C延伸l分钟，25个循环；72。C延伸7分钟。第二轮NIGSUF1/NIGSUR1引物的反应程序为94'C预变性5分钟；94"变性15秒，60'C复性15秒，72"延伸1分钟，35个循环；72匸延伸7分钟。第二轮的三重PCR反应程序为94'C预变性4分钟；94'C变性5秒，6rC复性2秒，72'C延伸50秒，35个循环；72"C延伸7分钟。5.3结果分析挑取10个菌株的3到数个冬孢子进行两对外套通用引物的第一轮扩增，然后进行内套通用引物和TCK、7Wo///、r.raw^y/特异引物三重套式第二轮扩增，采用阳性质粒作为阳性对照，以不添加冬孢子仅含PCR缓冲液作为阴性对照，扩增产物经电泳和EB染色后均能观察到特定目的大小带。内套通用引物扩增的片段应为700bp，阳性质控和所有菌株冬孢子经两轮套式扩增均能得到特定大小的目的片段(见图2)。图2中的13个泳道从左到右分别用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、M表示。阴性对照无相应产物(图2，其中l为阳性质粒，211分别为LMC353、LMC94、TCK2、TCK4、TCK7、Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l、V767，12为阴性对照)，M为DNA分子量标准(2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。这一结果表明两轮套式PCR扩增可以用于三种腥黑粉菌冬孢子的检测。TCK特异引物扩增的片段应为800bp，只有LMC353、LMC94和TCK2、TCK4、TCK7显示800bp的目的带(见图3)。图3中的12个泳道从左到右分别用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、M表示。图3中15泳道分别为LMC353、LMC94、TCK2、TCK4、TCK7，7:v"""'/的扩增片段约为550bp，只有Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l显示出特定大小的目的带(见图3中69泳道，69泳道分别为Lpl、Lp2、LpG、V21-711-l)，V767的扩增片段约为250bp，只有V767显示出特定大小的目的带(见图3中10泳道)，以及阴性对照无相应产物(见图3中11泳道)，M为DNA分子量标准(2000bp,1000bp,750bp，500bp)。这一结果表明通过外套通用引物和三重套式PCR扩增可以把TCK、r.wm^y/和7:/0///的冬孢子区别丌来。序列列表SEQUENCELISTING<110〉天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心<120>多年生黑麦草上三种腥黑粉菌近似种的检测方法<130>20080528<160>12<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>1ggatgcattctggggacgt<210>2<211〉22<212>DNA<213>人工合成<400>2gtagccttgttgctacgatctg<210>3<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>3caccgcccaagcscgtac<210>4<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>4gaccttttggggtcaaacttetc<210>5<211>15<212>DNA19221823<213>人工合成<400>5gaagtttccttcgcc<210>6<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>6acttctctcggaacatcactgt<210>7<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>7ggtggactgacattcgtc<210〉8<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>8cgcatgtccgtcggaccg<210>9<211>22<212>DNA<213〉人工合成<400>9aactgtatggatcatccagagc<210>10<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>10gtaatgccagaggattgtcct<210>11<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>11说明书第10/11页1522181822ctctgtgaggatatgcca18<210〉12<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>12gagaataactgttgtatgatgcca2权利要求1.一种利用PCR引物对多年生黑麦草(LoliumperenneL.)上的小麦矮腥黑穗菌(TilletiacontroversaKühn，简称TCK)、黑麦草腥黑粉菌(T.lolli)和T.vankyi进行检测的方法，这些引物既可以对这三种腥黑粉菌进行检测，又可以将它们区分开来，其特征在于，引物的序列和用途如下(1)腥黑粉菌属(Tilletia)通用引物，引物序列如下通用外套引物IGSUF1GGATGCATTCTGGGGACGTIGSUR1GTAGCCTTGTTGCTACGATCTG通用内套引物NIGSUF1CACCGCCCAAGCACGTACNIGSUR1GACCTTTTGGGGTCAAACTTCTC通用外套引物用于菌丝基因组DNA或冬孢子套式扩增，扩增片段约为900bp，通用内套引物用于冬孢子的套式扩增，扩增片段约为700bp，这两套引物用于TCK、T.lolli和T.vankyi的检测；(2)TCK、T.lolli、T.vankyi各自的特异引物和T.vankyi的外套引物，引物序列如下TCK的外套引物IGSUF1/IGSUR1TCK的特异引物LSKFGAAGTTTCCTTCGCCLSKRACTTCTCTCGGAACATCACTGT特异引物的扩增片段约为800bp，这两套引物用于TCK的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增，T.lolli的外套引物IGSUF1/IGSUR1T.lolli的特异引物LSLFGGTGGACTGACATTCGTCLSLRCGCATGTCCGTCGGACCG特异引物的扩增片段约为250bp，这两套引物用于T.lolli的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增，T.vankyi外套引物unFAACTGTATGGATCATCCAGAGCunRGTAATGCCAGAGGATTGTCCTT.vankyi特异引物LSNFCTCTGTGAGGATATGCCALSNRGAGAATAACTGTTGTATGATGCCA特异引物的扩增片段约为550bp，这两套引物用于T.vankyi的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增；TCK、T.lolli、T.vankyi三者的特异引物，用于菌丝基因组DNA三重特异性PCR扩增，特异性检测这三种菌丝体，各自的外套引物与特异引物的三重套式PCR扩增，用于特异性检测这三种真菌的冬孢子。2.根据权利要求1所述的一种利用PCR引物对多年生黑麦草ao/Z謂网re朋eL.)上的小麦矮腥黑穗菌(7H/etocoWraw"aKiihn，简称TCK)、黑麦草腥黑粉菌(7!和Ira"^y/进行检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)实验材料冬孢子的萌发和菌丝的培养；(2)菌丝基因组DNA的提取；(3)冬孢子的挑取与破碎；(4)菌丝基因组DNA三重PCR检测方法的建立；(5)冬孢子三重套式PCR检测方法的建立。3.权利要求1所述的一种检测多年生黑麦草上小麦矮腥黑穗菌、黑麦草腥黑粉菌和Z的方法以及12条引物在检测这三种腥黑粉菌近似种方面的应用。全文摘要本发明涉及使用PCR引物检测禾本科草种多年生黑麦草(LoliumperenneL.)上小麦矮腥黑穗菌(TilletiacontroversaKühn，简称TCK)、黑麦草腥黑粉菌(T.lolli)和T.vankyi的方法，属于禾本科草种腥黑粉菌检测领域。本发明自行设计了6套PCR引物，包括通用外套引物、内套引物、TCK和T.lolli特异引物以及T.vankyi的外套引物和特异引物。通用外套和内套引物用于TCK、T.lolli和T.vankyi基因组DNA或冬孢子套式扩增，进行质量检测，避免假阴性结果。TCK、T.lolli、T.vankyi各自的特异引物用于菌丝基因组DNA三重特异PCR扩增，可以将三者区别开来。TCK、T.lolli和T.vankyi各自的外套引物与特异引物三重套式PCR，可以特异性检测这三种冬孢子。本方法检测快速，结果可靠，整个检测过程可在一个工作日内完成。文档编号C12N15/11GK101328496SQ20081005381公开日2008年12月24日申请日期2008年7月11日优先权日2008年7月11日发明者勇刘,刘跃庭,崔铁军,芳廖,罗加凤,黄国明申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心