专利名称：通过胚状体发生途径建立多年生黑麦草遗传转化受体系统的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过胚状体发生途径建立多年生黑麦草遗传转化受体系统的方法，属于生物技术和现代农业生物技术领域。
背景技术：
多年生黑麦草属禾本科黑麦草属多年生草本植物。原产于南欧、北欧及亚洲西南。是世界温带降雨量多的地区广泛栽培的重要禾本科牧草。因其须根系发达，叶片质地细、柔软、叶色绿，建植速度快，分蘖能力及耐磨性强等特性，常作为水土保持混播种中的先锋植物，是一种重要的优良草坪草。
但多年生黑麦草根系入土不深，抗寒性差，在北京及以北地区越冬成活率较低，其耐热性及耐旱性也较差，当气温在35℃以上时，生长受阻，在干旱半干旱地区生长也不理想，因而严重限制了该种的广泛应用。许多研究者针对多年生黑麦草作为草坪草存在的缺点已开始了对其进行性状改良的研究。而多年生黑麦草为异花授粉植物，利用常规育种技术进行品种改良难度大，周期长。利用现代生物技术，特别是转基因技术对植物进行遗传改良具有高效、快捷等特点，在许多植物育种中已成功应用。为多年生黑麦草利用现代生物技术育种提供了重要的借鉴。多年生黑麦草的离体培养和转基因技术越来越受到重视。
建立多年生黑麦草高效稳定的遗传转化受体系统是利用转基因技术对其进行遗传改良的重要前提，但目前已报道的多年生黑麦草组织培养及植株再生体系均不完善，再生率偏低，不能满足转基因的需要。Dale(1977)通过根尖培养获得多年生黑麦草再生植株。Kran(1980，1981)；White(1987，1988)利用成熟胚为外植体进行组织培养获得再生植株。Creemers-Molenaar et al，(1988)Wang et al，(1993)，Dalton(1988)研究了不同培养方式对多年生黑麦草再生体系建立的影响，并初步建立了多年生黑麦草的固体培养、液体悬浮培养及原生质体悬浮培养再生体系。Creemers-Molenaar et al，(1988)以未成熟幼穗为外植体，研究了外源激素及培养环境对其植株再生影响，并获得了再生植株。1994年，陈文品以多年生幼穗为外植体，直接从幼穗诱导出再生不定芽。并形成完全植株。
上述研究报道均是以器官发芽途径获得的再生植株，且再生率都较低。胚状体是指脱分化的细胞团即愈伤组织在合适的培养条件下，部分细胞进一步发育，细胞内出现两极化，并经鱼雷胚、球形胚、心形胚等几个发育阶段形成与经有性繁殖形成的种子胚具有相似特性的体细胞。条件适宜，胚状体那可象种子一样萌芽，因此通过诱导体细胞形成的胚状体是利用转基因技术对多年生黑麦草进行遗传转化最理想的受体材料。成熟种子取材不受季节限制，且易于保存。因此，目前多集中以其成熟种子为外植体，研究进一步完善多年生黑麦草再生体系的方法与技术。遗憾的是，迄今为止，以成熟胚为外植体建立高频稳定的再生体系仍不理想。
发明内容
针对上述技术的不足及胚状体发生途径建立遗传转化受体的优点，本发明以多年生黑麦草成熟种子为外植体，高频诱导愈伤组织，获得的愈伤组织经继代培养及胚状体诱导培养后转入植株再生培养基诱导获得高频再生植株。从而建立起多年生黑麦草高效稳定的遗传转化受体系统，为进一步利用基因工程对其进行遗传改良奠定了技术平台。
本发明中所述的外植体是指无菌条件下，离体培养于人工培养基上的，用于达到培养目的的原始材料，本发明中使用的外植体是多年生黑麦草成熟种子。
本发明中所述的遗传转化受体系统是指为使载有目的基因的载体能顺利融合到宿主植物体并能使转化后的植物体形成完整而探索出的一个能使其离体材料在合适的培养条件下高频稳定的诱导再生植株的技术体系。本发明中的受体即为以多年生黑麦草为外植体建立的再生体系。
本发明所述的培养方法包括四个培养阶段(1)外植体培养诱导愈伤组织(2)愈伤组织继代培养(3)愈伤组织诱导胚状体(4)胚状体再生植株，其中(1)(2)为黑暗培养，(3)为200～500勒克斯的弱光培养，光照时间为12h/d，(4)为1500～3000勒克斯的光培养，光照时间为12h/d，整个培养过程，培养温度为20℃～30℃，每培养20～30天换新鲜培养基。
本发明通过上述四个阶段的培养从野牛草成熟胚外植体诱导出愈伤组织，并从愈伤组织进一步诱导出胚状体，通过胚状体再生途径得到了再生植株。
本发明中四个阶段的基本培养基均为是N6培养基(附表)。四个阶段所用激素为2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA、6-苄基氨基腺嘌呤6-BA和激动素KT的组合中选择出的任何一种、两种或三种，在第(1)阶段，培养基中还添加水解酪蛋白CH，第(4)阶段采用的基本培养基为大量元素用量减半的N6培养基，蔗糖为30g/L。
本发明所述的方法选优为第(1)阶段的培养基中所用外源激素及其浓度为2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 4～15mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤6-BA 0.1～2.0mg/L，萘乙酸NAA0.1～3.0mg/L，还添加了水解酪蛋白CH200～1000mg/L，在第(2)阶段的培养基中所用外源激素及其浓度为2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D2.0～10.0mg/L，激动素KT0.5～2mg/L。在第(3)阶段的培养基中所用外源激素及其浓度为2，4-二苯氧乙酸2，4-D 0.1～3.0mg/L，激动素KT0.1～2.0mg/L，在第(4)阶段的培养基添加6-苄基氨基腺嘌呤6-BA 0.5～2mg/L和激动素KT0.1～1mg/L的N6培养基，其中大量元素减半，蔗糖用量减至30g/L。
本发明特别优选的方法包括以下步骤(1)多年生黑麦草经灭菌后，接种于添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1～15mg/L、6-苄基氨基腺嘌呤6-BA 0.1～2.0mg/L，萘乙酸NAA0.1～3.0mg/L及水解酪蛋白CH200～1000mg/L的培养基；(2)诱导得到的愈伤组织接种于添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D2.0～10.0mg/L，激动素KT0.5～2mg/L的培养基，进行两次继代培养，继代周期20～30天；(3)选择胚性愈伤组织接种于添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.1～3.0mg/L，激动素KT0.1～2.0mg/L的培养基诱导胚状体，培养条件为弱光培养，光照强度为200～500勒克斯，(5)诱导得到的胚状体接种于添加6-苄基氨基腺嘌呤6-BA 0.5～2mg/L和激动素KT0.1～1mg/L的培养基，见光培养，光照强度为1500～3000勒克斯。
本发明将多年生黑麦草(Lolium perenne L.)成熟种子，用自来水浸泡0.5小时；洗涤剂与水以1∶50比例混合浸泡1小时，流动的自来水冲洗12小时后，70％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗5次；再用0.1％的升汞浸泡15min，以无菌水冲洗5～10次。无菌条件下用解剖刀将种子横切后接种至诱导第(1)阶段的培养基中，黑暗培养30天后在种子的切口处形成白色透明的愈伤组织。在上述第(1)阶段的培养基和培养条件下培养30天，愈伤组织诱导率达到85％以上，转入第(2)阶段的培养基，每25天继代一次，生长量体积约增长2.0-3.0倍，愈伤组织的质量有显著提高，出现结构紧密，淡黄色或乳白色的愈伤组织及质地松脆、淡黄色或乳白色、表面有乳状突起的愈伤组织。选取其中结构较致密的白色或淡黄色愈伤组织，转入第(3)阶段的培养基培养50天，胚状体(体细胞胚)诱导率达75％以上，将胚状体转入第(4)阶段的培养基，在光强为1500～3000勒克斯的光照条件下培养30天，植株再生率达86％以上。将再生植株在温度为25℃、湿度75％左右的玻璃温室中揭开封口膜炼苗3～4d。之后取出再生植株，洗净根部附着培养基，移栽到基质(珍珠岩∶草炭∶有机肥＝4∶2∶1)中，用塑料膜覆盖保湿。10d后，揭开塑料膜，成活率达95％。
本发明从多年生黑麦草成熟种子诱导出愈伤组织，并保持了愈伤组织良好的质量，所诱导出的胚状体(即体细胞胚)，能够产生高数量、稳定、均一的再生植株，因此此体系可用于基因工程或细胞工程育种。
图1诱导出的愈伤组织图2胚性愈伤组织的诱导图3愈伤组织的分化图4再生植株诱导图5移栽成活苗
具体实施例方式在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。
实施例1多年生黑麦草(Lolium perenne L.)成熟种子，用自来水浸泡0.5小时；洗涤剂与水以1∶50比例混合浸泡1小时，流动的自来水冲洗12小时后，70％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗5次；再用0.1％的升汞浸泡15min，以无菌水冲洗5～10次。无菌条件下用解剖刀将种子横切后接种至诱导愈伤组织的培养基，添加5.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，6-苄基氨基腺嘌呤6-BA 0.5mg/L，萘乙酸NAA0.5mg/L及水解酪蛋白CH 500mg/L的培养基，黑暗培养30天。其中，培养基的制备是将激素直接添加于N6培养基的其他成分中，然后高压灭菌而制得的。
所用仪器设备是植物组织培养所公知的超净工作机、自动高压灭菌锅等设备。在整个再生体系培养全过程中，培养基pH值均为5.8，温度均为25±1℃。
将诱导得到的愈伤组织转移至添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D5.0mg/L，激动素KT0.5mg/L的N6培养基，黑暗培养50天，其中每25天更换新鲜培养基。
选择结构较致密的白色或淡黄色的愈伤组织接种于添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.0mg/L，激动素KT 1.0mg/L的培养基诱导胚状体，培养条件为弱光培养，光照强度为200～500勒克斯将诱导的胚状体(体细胞胚)转入添加6-苄基氨基腺嘌呤6-BA 0.5mg/L和激动素KT0.5mg/L的N6培养基上，在光强为1500～3000勒克斯的光照条件下诱导培养，使其长成完整植株。光照时间在12h/d，胚状体经过30天的培养，长成根茎叶完整的植株，再生植株在温度为25℃、湿度75％左右的玻璃温室中揭开封口膜炼苗3～4d。之后取出再生植株，洗净根部残留的培养基，移栽到基质(珍珠岩∶草炭∶有机肥＝4∶2∶1)中，用塑料膜覆盖保湿。10d后，揭开塑料膜，即可进行大田移载。
上述方法所建立的再生体系，愈伤组织诱导率达到85.47％，胚状体诱导率达到76.83％，再生率达到86.2％，移栽成活率达到100％。
实施例2培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于愈伤组织诱导培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为8.0mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤6-BA为0.6mg/L，萘乙酸NAA为0.6mg/L，愈伤组织继代培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为8.0mg/L，激动素KT为0.6mg/L，胚状体诱导培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为0.7mg/L，激动素KT为1.0mg/L，在胚状体再生植株培养基中添加6-苄基氨基腺嘌呤6-BA为0.4mg/L和激动素KT0.4mg/L。
上述方法所建立的再生体系，愈伤组织诱导率达到85.25％，胚状体诱导率达到75.04％，再生率达到85.72％，移栽成活率达到97.5％。
实施例3培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于愈伤组织诱导培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为6.0mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤6-BA为0.8mg/L，萘乙酸NAA为0.3mg/L，愈伤组织继代培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为6.0mg/L，激动素KT为0.8mg/L，胚状体诱导培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为0.5mg/L，激动素KT为1.5mg/L，在胚状体再生植株培养基中添加6-苄基氨基腺嘌呤6-BA为0.8mg/L和激动素KT0.4mg/L。
上述方法所建立的再生体系，愈伤组织诱导率达到86.06％，胚状体诱导率达到75.33％，再生率达到85.2％，移栽成活率达到98％。
实施例4培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于愈伤组织诱导培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为10.0mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤6-BA为1.0mg/L，萘乙酸NAA为0.4mg/L，愈伤组织继代培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为10.0mg/L，激动素KT为0.7mg/L，胚状体诱导培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为0.8mg/L，激动素KT为1.0mg/L，在胚状体再生植株培养基中添加6-苄基氨基腺嘌呤6-BA为0.6mg/L和激动素KT0.6mg/L。
上述方法所建立的再生体系，愈伤组织诱导率达到86.06％，胚状体诱导率达到77.23％，再生率达到87.12％，移栽成活率达到96％。
实施例5培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于愈伤组织诱导培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为9.0mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤6-BA为0.8mg/L，萘乙酸NAA为0.4mg/L，愈伤组织继代培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为5.0mg/L，激动素KT为0.8mg/L，胚状体诱导培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为0.5mg/L，激动素KT为1.5mg/L，在胚状体再生植株培养基中添加6-苄基氨基腺嘌呤6-BA为0.6mg/L和激动素KT0.6mg/L。
上述方法所建立的再生体系，愈伤组织诱导率达到86.06％，胚状体诱导率达到78.67％，再生率达到88.32％，移栽成活率达到98％。
实施例6培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于愈伤组织诱导培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为7.0mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤6-BA为0.4mg/L，萘乙酸NAA为0.6mg/L，愈伤组织继代培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为4.0mg/L，激动素KT为0.8mg/L，胚状体诱导培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为1.2mg/L，激动素KT为1.0mg/L，在胚状体再生植株培养基中添加6-苄基氨基腺嘌呤6-BA为0.4mg/L和激动素KT0.5mg/L。
上述方法所建立的再生体系，愈伤组织诱导率达到86.76％，胚状体诱导率达到77.12％，再生率达到85.06％，移栽成活率达到100％。
附表N6基本培养基(朱至清，1974)
权利要求
1.通过胚状体发生途径建立多年生黑麦草遗传转化受体系统的方法，其特征在于以多年生黑麦草成熟种子为外植体，进行培养。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述方法包括四个培养阶段(1)外植体培养诱导愈伤组织(2)愈伤组织继代培养(3)愈伤组织诱导胚状体(4)胚状体再生植株，其中(1)(2)为黑暗培养，(3)为200～500勒克斯的弱光培养，光照时间为12h/d，(4)为1500～3000勒克斯的光培养，光照时间为12h/d，整个培养过程，培养温度为20℃～30℃，每培养20～30天换新鲜培养基。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于四个阶段的基本培养基均为是N6培养基。四个阶段所用激素为2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA、6-苄基氨基腺嘌呤6-BA和激动素KT的组合中选择出的任何一种、两种或三种，在第(1)阶段，培养基中还添加水解酪蛋白CH，第(4)阶段采用的基本培养基为大量元素用量减半的N6培养基，蔗糖为30g/L。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于在第(1)阶段的培养基中所用外源激素及其浓度为2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1～15mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤6-BA0.1～2.0mg/L，萘乙酸NAA0.1～3.0mg/L，还添加了水解酪蛋白CH200～1000mg/L，在第(2)阶段的培养基中所用外源激素及其浓度为2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D2.0～10.0mg/L，激动素KT0.5～2mg/L。在第(3)阶段的培养基中所用外源激素及其浓度为2，4-二苯氧乙酸2，4-D 0.1～3.0mg/L，激动素KT0.1～2.0mg/L，在第(4)阶段的培养基添加6-苄基氨基腺嘌呤6-BA 0.5～2mg/L和激动素KT0.1～1mg/L的N6培养基，其中大量元素减半，蔗糖用量减至30g/L。5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)多年生黑麦草经灭菌后，接种于添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1～15mg/L、6-苄基氨基腺嘌呤6-BA 0.1～2.0mg/L，萘乙酸NAA0.1～3.0mg/L及水解酪蛋白CH200～1000mg/L的培养基；(2)诱导得到的愈伤组织接种于添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D2.0～10.0mg/L，激动素KT0.5～2mg/L的培养基，进行两次继代培养，继代周期20～30天；(3)选择胚性愈伤组织接种于添加2，4-二苯氧乙酸2，4-D0.1～3.0mg/L，激动素KT0.1～2.0mg/L的培养基诱导胚状体，培养条件为弱光培养，光照强度为200～500勒克斯，(5)诱导得到的胚状体接种于添加6-苄基氨基腺嘌呤6-BA 0.5～2mg/L和激动素KT0.1～1mg/L的培养基，见光培养，光照强度为1500～3000勒克斯。
全文摘要
本发明公开一种通过胚状体发生途径建立多年生黑麦草遗传转化受体系统的方法，主要步骤包括以多年生黑麦草成熟种子为材料，在诱导培养基中培养获得愈伤组织，经继代培养后，在胚性愈伤组织诱导培养基及再生培养基中高频诱导胚状体及再生植株。在诱导愈伤组织培养基通过添加一定配比的2，4－D、6－BA、NAA以及水解酪蛋白CH可有效地提高了愈伤组织的诱导率。在继代培养到再生培养过程，通过改变植物生长调节剂浓度配比，胚状体诱导率达75％以上，植株再生率达85％以上。
文档编号A01H4/00GK1737127SQ20051009007
公开日2006年2月22日 申请日期2005年8月12日 优先权日2005年8月12日
发明者孙振元, 冯霞, 彭镇华, 韩蕾, 钱永强 申请人:中国林业科学研究院林业研究所