专利名称：小麦矮腥黑粉菌检测的一种pcr方法
技术领域：
本发明小麦矮腥黑粉菌检测的一种PCR方法，属于生物技术领域。专用于海关进出境小麦所带小麦矮腥黑粉菌的高灵敏度快速检测，同时可用于田间小麦矮腥黑粉病的早期诊断及检测。
本发明的研究背景小麦世界最重要的粮食作物之一，也是我国的第二大粮食作物。小麦矮腥黑粉菌引起的小麦矮腥黑穗病是我国的一类危险性病害，1935年Young首次正式确认小麦矮腥黑穗病不同于小麦普通腥黑穗病。调查结果表明，小麦矮腥黑穗病在土耳其、伊朗和伊拉克等国也均有发生，目前小麦矮腥黑穗病的分布已遍及欧洲、西亚、北非和北美等地。土耳其的安纳托利亚东部和海拔高度在1300～2000米的伊朗西北部均被列入最严重的发病地区之一；美国西北部的爱达荷、犹他、俄勒冈、华盛顿、蒙大拿、科罗拉多、怀俄明等7个州和大湖区的密执安、印第安那、纽约等3个州的小麦主产区，也是小麦矮腥黑穗病的常发区。除了危害Triticumspp.外，T.controversa也发生在许多禾本科植物上，包括Aegilops，Agropyron，Agrostus，Alopecurus，Arrhenatherum，Beckmannia，Bromus，Dactylis，Elyaus，Festuca，Holcus，Hordeum，Koeleria，Lolium，Poa，Secale和Trisetum及XTriticosecale等属的种(Hardison等1959，Schuhmann 1960，Duran和Fischer 1961，Hoffmann和Waldher 1964，Ozkan1971)。许多禾本科植物是经人工接种之后才被确定为寄主的，且只有在特殊情形下才被认为是寄主。小麦矮腥黑粉菌属于担子菌亚门(Basidiomycotina)，异担子纲(Heterobasidiomycetes)，黑粉菌目(Ustilaginales)，腥黑粉菌科(Tilletiaceae)，腥黑粉菌属(Tilletia)，该菌，主要靠土壤传播，但混杂在小麦中的病粒和病菌冬孢子是病害远距离传播的主要形式，小麦矮腥黑粉菌抗逆性极强，病粒及其碎块中的冬孢子可在土中存活3～7年，甚至可以长达10年以上。小麦矮腥黑粉菌侵染小麦后，会造成植株矮化，籽粒变为黑粉菌瘿，病穗颗粒无收。通常小麦矮腥黑粉菌每侵染1％的麦穗，即可减少大约0.8％的产量。据Hoffmann(1982)报道，在流行年份小麦矮腥黑穗病引起的产量损失一般为20％～50％，严重时可达75％～90％，甚至绝产。
到目前为止还没有特别有效的化学药剂或抗性品种来防治此病害，因为小麦矮腥黑粉菌主要通过种子、病残体及带菌土传播，所以目前主要控制方法是通过种子检验检疫。全世界的学者都认为，有必要建立一种准确率和灵敏度均高的快速检测方法来检测小麦矮腥黑粉菌，尤其是无症状的植株或种子及调运种子时携带的土壤的检测。由于该病是我国的一类检疫性病害，因此在我国检疫是主要的控制此病害的手段，严格限制或禁止从发生此病害的国家和地区禁口小麦种子，从其它国家禁口的种子必须进行有关的检验。目前小麦矮腥黑粉菌具体的检测手段主要是1.症状观察，但只能作为初步检验，做出初步判断；2.分离、纯化病原菌，根据小麦矮腥黑粉菌的冬孢子形态特征主要有孢子大小、孢子网脊高度、孢子囊厚度、网眼宽度、胶质鞘厚度和冬孢子与不育孢子的比率。用其相似种小麦网腥黑粉菌的冬孢子同其进行比较发现，两个种形态学上的主要特征明显交叉重叠。3.生化方法鉴定，根据小麦矮腥黑粉菌冬孢子的生理萌发、孢子壁的水解反应、凝集反应、冬孢子壁高碘酸反应、冬孢子在有机溶剂里的变形等特性来鉴别与其他黑粉菌的不同。上述几种鉴别小麦矮腥黑粉菌同其他腥黑粉菌的方法，仅适用于成熟的孢子，且该孢子应在干燥的条件下。孢子形态学鉴定、生物化学鉴定等方法，基本上能满足进境原粮检疫的技术需求，但还存在着方法繁复、难度较大、时间较长、准确度不高等不足。随着分子生物学的发展，许多病原物已经有了精度很高、简便易行的分子检测方法。例如，美国农业部农业研究中心Smith(1996)发明了小麦印度腥黑粉病菌的PCR检测方法，其专化性引物是根据该病菌线粒体DNA片段序列分析的结果而设计的，现已申请了专利。Zerucha等(1999)通过对5S rRNA基因内转录间隔区(ITS)进行研究，以能在这段保守序列中找到特异性标记，但结果发现，小麦矮腥黑粉菌和其他腥黑粉菌没有明显差异。Bakkeren等(2000)用AFLP方法对不同的小麦黑粉菌进行标记，同5S rRNA基因内转录间隔区(ITS)标记比较，认为AFLP方法具有更丰富的多态性片段，更适合小麦腥黑粉菌整个基因组的分子标记。
随着近年来我国口岸在中美贸易中进口小麦、大麦等禾本科作物的增多，该病菌从疫区进入我国的机会亦增多，但我国口岸缺乏必要的对该菌的检测方法。病害防治、预测预报及植物检疫需要有准确快速的病菌检测方法，尤其是需要我国拥有自主知识产权的检测方法，从而可以将之投入到商业生产和应用中，目前在这一领域还没有一种既灵敏特异又快速的小麦矮腥黑粉菌检测及早期诊断方法的报道。此项发明满足了这些需求。
本发明的目的本发明的目的是解决现有技术中小麦矮腥黑粉菌的生物学检测方法所需周期长、鉴定困难等问题，提供小麦矮腥黑粉菌检测的PCR方法，检测小麦种子带小麦矮腥黑粉菌及对感病小麦进行早期诊断，准确性高、周期短、灵敏性好。
本发明的技术方案小麦矮腥黑粉菌的特异性引物序列如下PrimerT15′-CTCCGACGACGAAGTATAGCG-3′PrimerT25′-GGTATACGCGGCACCATATGC-3′试剂盒反应体系1mL检测溶液包括50mmol.L-1Tris.Cl、125mmol.L-1KCl、2.5mmol.L-1MgCl2、10mMdNTPs、上、下游引物0.25mmol/mL、0.1mg.mL-1BSA、Taq DNA聚合酶100单位。该溶液储存于-20℃冰箱。保存期限为1年。
上述小麦矮腥黑粉菌检测引物及试剂盒反应体系用于小麦矮腥黑粉菌检测的一种PCR方法，包括1)种子表明携带病原菌DNA提取取待测小麦种子50g，加入150ml三角瓶中；加入100ml含有0.1％吐温20的蒸馏水，用封口膜封口，人工或振荡(150rpm)摇匀10分钟(不要超过30分钟)；剧烈涡旋三角瓶并迅速将小麦及水倒入上面放有53μm分子筛的600ml烧杯中，弃去分子筛中物质；同样，将烧杯中溶液转移到另一个上面放有13μm分子筛的600ml烧杯中，用100ml含有0.1％吐温20的水冲洗1～2次，保留分子筛上物质；用洗瓶将13μm分子筛的物质转移到50ml锥形离心管中，配平，3000rpm(1614g)离心3分钟，立即小心弃去上清液；加入300μl水，用枪头吹吸沉淀，促其溶解，并将溶液转移到1.5ml离心管中，重复3次；3000rpm离心3分钟，弃去上清；加入100μl PCR反应液，振荡混匀，取10μl于无菌载玻片上，用解剖针在显微镜下将孢子压碎，小心将其转移到PCR管中，并加入5μl无菌水和3μl无菌吐温20纯溶液一起转移到同一PCR管中，60℃水浴0.5小时后用于PCR；2)从发病的植物组织中提取DNA取0.2g发病植物组织在液氮中研磨成粉末；将粉末移至1.5mL离心管中，加入0.4～4％(克/100毫升)的脱脂奶粉，加入450μL细胞裂解液(30mL 0.5mol/L EDTA，5mL 1mol/LTris，15mL 20％(克/100毫升)SDS，灭菌超纯水70mL)和2μL 10μg/mL蛋白酶K，充分混匀后52℃水浴1小时，水浴时每10分钟轻轻颠倒离心管使溶液混匀；12000r·min-1转速下离心5分钟得上清，加入等体积氯仿抽提，在12000r·min-1转速下离心10分钟，吸取上清；加入1/2体积的7.5M NH4Ac，2倍体积的预冷的无水冰乙醇，室温沉淀30分钟，12000r·min-1转速下离心10分钟，倒干液体；加1mL 70％(V/V)乙醇洗涤，12000r·min-1转速下离心10分钟，倒干液体，晾干至无酒精味；溶于50μL灭菌的超纯水中，-20℃冰箱中保存备用。
3)小麦矮腥黑粉菌的PCR检测取1μLDNA溶液，加入10μL试剂盒溶液和14μL灭菌超纯水，总体积25μL；PCR扩增程序为94℃变性2分钟；进入循环，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸120秒，35个循环；最后72℃延伸5分钟；扩增产物的电泳检测取10μL PCR扩增产物，在1％(克/100毫升)的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100W，30分钟后在紫外光下检测结果；如果存在分子量约为367bp的DNA条带，则证明所检测病原为小麦矮腥黑粉菌。
本发明的有益效果本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在(1)实用性好直接从病组织或种子检测小麦矮腥黑粉菌具有重要的实际应用价值。小麦矮腥黑粉菌随贸易往来最可能的传播途径是种子调运及随小麦中的土壤或病残体(如颖壳、根等)传播，在贸易口岸中，检疫部门主要是通过对土壤和病残体中病菌的分离、鉴定来判别是否携带小麦矮腥黑粉菌。但是目前的检测方法需要对该病菌进行分离纯化，需要15-20天的时间；且分离过程中很容易受一些腐生菌的干扰，无法满足海关检疫的需要。为了使我们的检疫方法具有实际的应用价值，我们采用直接从种子和发病组织中提取DNA后直接进行PCR扩增，可在6～8小时内完成对小麦矮腥黑粉菌的检测。因此本方法大大提高了检测的效率。
(2)准确性高用于传统小麦矮腥黑粉菌的检测技术只是根据形态特征来确定检疫对象，无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相似种，从而导致准确性不高；而本发明根据小麦矮腥黑粉菌的特异性序列，选择小麦矮腥黑粉菌特有的一段保守序列做特异引物，能根据变异序列设计特异性引物进行扩增比较，为病原菌的鉴定和检测提供准确的靶标位点。经过与小麦矮腥黑粉菌以及其它不同植物病原菌的比较，该引物的准确率高。
(3)操作简便快速应用本发明方法，提取种子及发病植株DNA、PCR扩增和常规琼脂糖电泳即可判定检测结果，无须对病原菌进行培养，一般检测过程可在6～8小时完成。
图1引物对小麦矮腥黑穗病菌14个地理种群扩增的AFLP图谱1-3小麦光腥黑穗病菌；4玉米丝黑穗病菌；5-18小麦矮腥黑穗病菌图2引物对小麦矮腥黑穗病菌17个小种扩增的AFLP图谱1-2λDNA；3-5小麦网腥黑穗病菌；6-22小麦矮腥黑穗病菌图3引物对小麦不同腥黑穗病菌扩增的AFLP图谱1λDNA；2-10小麦矮腥黑穗病菌；11-12小麦光腥黑穗病菌；13印度腥黑穗病菌；14-22小麦网腥黑穗病菌图4小麦矮腥黑粉菌的特异PCR扩增1为分子量标记，2～13为不同来源的小麦矮腥黑粉菌；14为小麦光腥黑粉菌；15为小麦印度腥黑粉菌；16为玉米黑粉菌；17为小麦散黑粉菌；18为小麦网腥黑粉菌本发明的具体实施方案以下叙述本发明的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。
需特别指出的是，尽管在实施例中详尽描述了小麦矮腥黑粉菌检测的特异性引物及检测方法，然而这并不意味本发明的引物序列只限于用小麦矮腥黑粉菌的检测。因此，使用本发明所描述的小麦矮腥黑粉菌的检测技术、检测用引物，以本领域普通技术人员所具有的任何涉及上述的引物、方法检测其他作物病原真菌和其他方面的应用，均包括在本发明所要求的权利范围之内。
实例1种子带菌检测取待测小麦种子50g，加入150ml三角瓶中；加入100ml含有0.1％吐温20的蒸馏水，用封口膜封口，人工或振荡(150rpm)摇匀10分钟(不要超过30分钟)；剧烈涡旋三角瓶并迅速将小麦及水倒入上面放有53μm分子筛的600ml烧杯中，弃去分子筛中物质；同样，将烧杯中溶液转移到另一个上面放有13μm分子筛的600ml烧杯中，用100ml含有0.1％吐温20的水冲洗1～2次，保留分子筛上物质；用洗瓶将13μm分子筛的物质转移到50ml锥形离心管中，配平，3000rpm(1614g)离心3分钟，立即小心弃去上清液；加入300μl水，用枪头吹吸沉淀，促其溶解，并将溶液转移到1.5ml离心管中，重复3次；3000rpm离心3分钟，弃去上清；加入100μl PCR反应液，振荡混匀，取10μl于无菌载玻片上，用解剖针在显微镜下将孢子压碎，小心将其转移到PCR管中，并加入5μl无菌水和3μl无菌吐温20纯溶液一起转移到同一PCR管中，60℃水浴0.5小时后用于PCR；取1μLDNA溶液，加入10μL试剂盒溶液和14μL灭菌超纯水，总体积25μL；PCR扩增程序为94℃变性2分钟；进入循环，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸120秒，35个循环；最后72℃延伸5分钟；扩增产物的电泳检测取10μLPCR扩增产物，在1％(克/100毫升)的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100W，30分钟后在紫外光下检测结果；如果存在分子量约为367bp的DNA条带，则证明所检测病原为小麦矮腥黑粉菌。
实例2发病植物组织检测取0.2g发病植物组织在液氮中研磨成粉末；将粉末移至1.5mL离心管中，加入0.4～4％(克/100毫升)的脱脂奶粉，加入450μL细胞裂解液(30mL 0.5mol/L EDTA，5mL 1mol/LTris，15mL20％(克/100毫升)SDS，灭菌超纯水70mL)和2μL 10μg/mL蛋白酶K，充分混匀后52℃水浴1小时，水浴时每10分钟轻轻颠倒离心管使溶液混匀；12000r·min-1转速下离心5分钟得上清，加入等体积氯仿抽提，在12000r·min-1转速下离心10分钟，吸取上清；加入1/2体积的7.5M NH4Ac，2倍体积的预冷的无水冰乙醇，室温沉淀30分钟，12000r·min-1转速下离心10分钟，倒干液体；加1mL 70％(V/V)乙醇洗涤，12000r·min-1转速下离心10分钟，倒干液体，晾干至无酒精味；溶于50μL灭菌的超纯水中，-20℃冰箱中保存备用。
取1μL DNA溶液，加入10μL试剂盒溶液和14μL灭菌超纯水，总体积25μL；PCR扩增程序为94℃变性2分钟；进入循环，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸120秒，35个循环；最后72℃延伸5分钟；扩增产物的电泳检测取10μLPCR扩增产物，在1％(克/100毫升)的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100W，30分钟后在紫外光下检测结果；如果存在分子量约为367bp的DNA条带，则证明所检测病原为小麦矮腥黑粉菌。
实施结果以上两例中利用引物primerT1/T2以含有小麦矮腥黑粉菌的DNA为模板，以该菌近缘种为对照进行PCR扩增。在2-13泳道的小麦矮腥黑粉菌DNA中扩增出了367bp的条带(见附图4的2-13泳道)。在其他5个近缘种中均无扩增产物。说明我们所筛选的引物PCR扩增的特异性强。附件由引物PrimerT1/T2扩增出的小麦矮腥黑粉菌特异性DNA序列CT CCGACGACGA AGTATAGCGT CTGGCTGAGA ACCTGAAGAA AGGTATGCCA ATCGCCACTC CGGTGTNAGANGGCGCGAAA GAGAGCGAAA TCAAAGAGCT GCTGCAGCTC GGCGGCTTGC CTTCTTCCGG TCAGATTACCCTGTTTGACG GCCGTACCGG TGAGCAGTTC GAACGTCAGG TAACCGTTGG CTACATGTAC ATGCTGAAACTCAACCACCT GGTTGATGAC AAGATGCATG CACGTTCAAC CGGTTCCTAC AGCCTGGTTA CTCAGCAGCCGCTGGGTGGT AAGGCACAGT TCGGTGGTCA GCGCTTTGGT GAGATGGAAG TATGGGCACT GGAAGCATATGGTGCCGCGT ATACC
权利要求
1.包括小麦矮腥黑粉菌特异性检测引物一对，Primer T1/T2，其序列为Primer T15′-CTCCGACGACGAAGTATAGCG-3′Primer T25′-GGTATACGCGGCACCATATGC-3′其中Primer T1/T2引物对在小麦矮腥黑粉菌中特异性扩增出367bp的产物。
2.权利要求1所述小麦矮腥黑粉菌特异性检测的用法，包括检测试剂盒反应体系1mL检测溶液包括50mmol.L-1Tris.Cl、125mmol.L-1KCl、2.5mmol.L-1MgCl2、10mMdNTPs、Primer T2/T2各0.25mmol/mL、0.1mg.mL-1BSA、Taq DNA聚合酶100单位。PCR扩增采用25μL反应体系取1μL DNA溶液(含有10ng以上DNA)，加入10μL试剂盒溶液和14μL灭菌超纯水，总体积25μL；PCR扩增程序为94℃变性2分钟；进入循环，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸120秒，35个循环；最后72℃延伸5分钟。
全文摘要
本发明为“小麦矮腥黑粉菌检测的一种PCR方法”，属生物技术和植物检疫领域。本发明涉及的小麦矮腥黑粉菌检测的一种PCR方法，其特征是该方法应用PCR技术快速检测小麦种子带有的矮腥黑粉菌及感病植株的早期诊断，提高了灵敏度和准确性并且快速。还涉及PCR引物序列及检测试剂盒。本发明在小麦矮腥黑穗病种子带菌及早期诊断方面，具有很高的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK1891835SQ20051008007
公开日2007年1月10日 申请日期2005年6月29日 优先权日2005年6月29日
发明者陈万权, 刘太国, 刘建华 申请人:中国农业科学院植物保护研究所