技术简介：
该发明提出了一种卡拉胶四、六糖的酶解制备和检测方法。现有技术中，主要采用酸法降解卡拉胶生产低聚糖，产物复杂且得率不高。本发明使用卡拉胶酶在特定条件下对κ-卡拉胶进行降解，并通过乙醇分级等步骤纯化产物，最后利用MALDI-TOF-MS技术检测产物组成和分子量，实现了高效制备高品质的卡拉胶四、六糖。
关键词：卡拉胶,低聚糖,酶解法,高效生产
专利名称：卡拉胶四、六糖的酶解制备和检测方法
技术领域：
本发明涉及一种卡拉胶四、六糖的制备和检测方法。
背景技术：
国外专利和文献中可见到利用κ-卡拉胶酶制备卡拉胶低聚糖的研究，但并未对卡拉胶四、六糖的酶解制备和检测方法进行描述。国内没有酶解制备卡拉胶低聚糖的报告和相关专利的提出。已报道的方法以酸解法为主，所制备的卡拉胶低聚糖产物组成复杂，难以高效、稳定地生产卡拉胶四、六糖。
日本专利JP2000116376报道了一种可用于新卡拉胶低聚糖和海藻细胞原生质体制备的卡拉胶酶，但并未对酶解产物的具体组成和结构进行描述。
日本专利JP2001501478对一种ι-卡拉胶酶及其编码基因进行了报道，但并未对酶解产物的具体组成和结构进行描述。
韩国专利KR2001018800报道了一种制备卡拉胶寡糖的方法，该方法采用的是有机酸法。
中国专利申请号02135275.5报道了一种卡拉胶低聚糖的制备方法，该方法采用的是稀硫酸或稀盐酸降解的方法，产物组成复杂。
中国专利申请号01107953.3报道了一种κ-卡拉胶寡糖的制造方法，该方法采用的是酸水解，将κ-卡拉胶用硫酸水溶液配成溶胶，并在水浴中加热进行反应。
中国专利申请号03138968.6报道了一种κ-卡拉胶寡糖单体的制备方法，该方法将κ-卡拉胶用酸降解，用Superdex 30柱进行分离，获得聚合度为7～25的奇数κ-卡拉胶寡糖。
发明内容本发明的目的是提供一种卡拉胶四、六糖的酶解制备方法，以及对产物组成的检测方法。该制备方法同已有报道方法相比，制备过程简单、产物组成简单、得率高、产品质量稳定，可用于卡拉胶四、六糖的规模化生产。制备的卡拉胶四、六糖产品可用于构效关系研究，为低聚糖药物和保健食品的研制开发提供高品质的候选化合物。
卡拉胶四、六糖的酶解制备和检测方法，包括使κ-卡拉胶溶于NaCl溶液中，加入卡拉胶酶进行反应，用沸水浴加热使酶失活，离心后除去沉淀杂质，浓缩后乙醇分级，冷冻干燥后获得卡拉胶四、六糖片段，采用基体辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对产物的组成和分子量进行检测。
本发明的制备方法对环境设备要求不高，简单易行，成本低廉，适于推广。
具体实施方法取2gκ-卡拉胶溶于100ml 0.3％NaCl溶液中，加入5单位的κ-卡拉胶酶粉，1个酶活力单位定义为在32℃条件下，每min产生1μmol还原糖(以半乳糖计)所需要的酶量。于32℃150r/min振荡反应18小时，用沸水浴加热使酶失活，冷却后加入2倍体积的乙醇，3000r/min离心分离7min以去除杂质，上清液于60℃旋转蒸发进行浓缩至20ml，然后加入3倍体积的乙醇使低聚糖得到沉淀，离心收集沉淀物，经脱盐、冻干后得到降解产物，以2，5-二羟基苯甲酸(DHB)为基体，与降解产物混合后，采用基体辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行分析，产物为卡拉胶四、六糖。
本实施例所述的反应温度为30～35℃，所述的酶解反应时间为18～24小时。
采用基体辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)确定降解产物的组成和分子量范围，附图表明卡拉胶酶解产物为组成简单的卡拉胶四、六糖。
峰组成I带有1个硫酸基团的卡拉胶四糖，分子量为732；峰组成II带有2个硫酸基团的卡拉胶四糖，分子量为834；峰组成III带有2个硫酸基团的卡拉胶六糖，分子量为1140；峰组成IV带有3个硫酸基团的卡拉胶六糖，分子量为1242。
权利要求1.一种卡拉胶四、六糖的酶解制备方法，包括将κ-卡拉胶在控制反应温度和反应时间的条件下进行降解，再通过乙醇分级法将降解产物进行分级，其特征是所述的降解是用κ-卡拉胶酶降解，所制备的降解产物为卡拉胶四、六糖。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的反应温度为30～35℃，所述的反应时间为18～24小时，所述的乙醇用量为2～3倍。
3.一种卡拉胶四、六糖的检测方法，采用基体辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对产物的组成和分子量进行检测。
全文摘要本发明涉及一种卡拉胶四、六糖的制备和检测方法。本发明的目的是提供一种卡拉胶四、六糖的酶解制备方法，以及对产物组成的检测方法。该制备方法同已有报道方法相比，制备过程简单、产物组成简单、得率高、产品质量稳定，可用于卡拉胶四、六糖的规模化生产。制备的卡拉胶四、六糖产品可用于构效关系研究，为低聚糖药物和保健食品的研制开发提供高品质的候选化合物。卡拉胶四、六糖的酶解制备和检测方法，包括使κ—卡拉胶溶于NaCl溶液中，加入卡拉胶酶进行反应，用沸水浴加热使酶失活，离心后除去沉淀杂质，浓缩后乙醇分级，冷冻干燥后获得卡拉胶四、六糖片段，采用基体辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI－TOF－MS)对产物的组成和分子量进行检测。本发明的制备方法对环境设备要求不高，简单易行，成本低廉，适于推广。
文档编号C12P19/00GK1880467SQ20051007931
公开日2006年12月20日 申请日期2005年6月17日 优先权日2005年6月17日
发明者牟海津, 江晓路, 刘志鸿 申请人:中国海洋大学