一种ι-卡拉胶降解酶基因及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】一种ι-卡拉胶降解酶基因及其制备方法和应用，涉及ι-卡拉胶酶。ι-卡拉胶酶基因cgiA2_Ce是编码Cellulophaga?sp.KL-A的卡拉胶酶基因。ι-卡拉胶重组酶CgiA2_Ce可在降解ι-卡拉胶中应用，降解产物为2个ι-卡拉胶寡糖，聚合度分别为2-4糖和6-10糖。所述降解产物可在制备抗菌剂，抗病毒剂、免疫调节剂、抗氧化剂等中应用，尤其是在用于海水养殖中的抗菌剂，抗病毒剂、免疫调节剂、抗氧化剂等中应用，对虾的存活率可提高20%～30%。ι-卡拉胶酶基因cgiA2_Ce，可通过基因工程技术获得其重组蛋白。
【专利说明】一种1-卡拉胶降解酶基因及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及1-卡拉胶酶，尤其是涉及一种来源于Cellulophaga sp.KL-A的
1-卡拉胶酶基因cgiA2_Ce及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]卡拉胶(Carrageenan)，又名鹿角胶、角叉胶等，是从红藻中提取的一种高分子亲水性多糖，以重复的α-(1 — 4)-D_半乳吡喃糖-β-(1 — 3)-D_半乳吡喃糖(或3，6内醚-D-半乳吡喃糖)二糖单元为基本骨架连接而成。根据是否含有3，6内醚-D-半乳吡喃糖、硫酸基的含量以及硫酸基在分子中的位置不同，将卡拉胶主要分为K、λ、t，三族。
[0003]卡拉胶因具有优良的热可逆凝胶化、抗蛋白凝胶、亲水无毒等性能而广泛应用于食品工业中。目前卡拉胶已广泛应用于果冻、软糖、冰淇淋、肉制品、啤酒等食品工业中，主要作用表现在凝胶、增稠和蛋白反应性3个方面。随着人们对卡拉胶结构和功能认识的深入，其应用领域不断拓宽，尤其在医药领域的应用变得日益广泛。
[0004]已有研究成果表明，卡拉胶具有多种生物活性，如抗凝血、抗病毒、免疫调节、抗氧化等，但由于卡拉胶相对分子质量过大，使其溶解性和吸收性受到影响，限制了其在医药领域的应用。卡拉胶寡糖与之相比，相对分子质量较小，溶解性、稳定性和安全性都有所增加，且生物活性也具有一定程度 的提高。
[0005]目前降解卡拉胶的方法有物理法、化学法、酶解法。其中酶降解法是制备寡糖的一个重要途径，由于其具有特异性，可选择性地酶解切断糖链上的特定位点，从而制得特定的寡糖；并且反应条件温和，降解过程易于控制，在多糖降解中的运用日益增多。目前，国内外学者对卡拉胶寡糖进行的研究，已有成果表明卡拉胶寡糖在功能性食品、医药等领域具有一定的应用价值和开发前景。因此，利用从海洋微生物中提取到的卡拉胶降解酶制备卡拉胶低分子量活性片段，成为卡拉胶工业高值化研究的重要方向。
[0006]目前研究较多的卡拉胶降解酶主要集中在K-和λ-两族，对t-卡拉胶降解酶比较少，而且寡糖的纯化较困难；本发明获得的卡拉胶酶基因降解产物仅有2个，便于后续纯化，对研究1-卡拉胶的水解机制，水解产生的1-卡拉胶寡糖在科研和实际生产应用中都具有较高价值。
[0007]中国专利CN1544623公开一种K 一卡拉胶降解酶及其制备方法和应用，一种酶能使K 一卡拉胶降解，用于制备卡拉胶低聚糖，能够降解K 一卡拉胶的β — 1，4 一糖苷键，故亦称为K 一卡拉胶降解酶，该酶的分子量为30，OOODa。制备该酶时，将海洋噬纤维菌用2216E培养基28 - 35°C摇瓶培养后，将培养液离心获得发酵酶液，将酶液超滤浓缩后，以40 % — 80 %的(NH4) 2S04盐析收集沉淀蛋白，冷冻干燥。
【发明内容】
[0008]本发明的第一目的在于提供来源于Cellulophaga sp.KL-A的卡拉胶酶基因cgiA2—Ce。[0009]本发明的第二目的在于提供t -卡拉胶重组酶CgiA2_Ce。
[0010]本发明的第三目的在于提供^ -卡拉胶降解酶基因的制备方法。
[0011]本发明的第四目的在于提供^ -卡拉胶重组酶CgiA2_Ce在降解t -卡拉胶中的应用。
[0012]所述1-卡拉胶酶基因cgiA2_Ce是编码Cellulophaga sp.KL-A的卡拉胶酶基因，DNA序列、氨基酸序列如序列表所示。
[0013]所述1-卡拉胶酶基因cgiA2_Ce，可使用包含pET_32a表达载体，pET_28a表达载体，pET-24a表达载体，pET-22b表达载体，pGEX_6p表达载体等多种表达载体。
[0014]所述t -卡拉胶重组酶CgiA2_Ce，可使用包含大肠杆菌的表达系统，酿酒酵母的表达系统，枯草芽孢杆菌的表达系统等表达。
[0015]所述t -卡拉胶降解酶基因的制备方法的具体步骤如下:
[0016]挑取大肠杆菌重组菌株BL21 (DE3)-pET32a_cgiA2_Ce单克隆于含有浓度为100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜，按1%接种量接种至200mL同样LB液体培养基中，37 °C 180rpm振荡培养至0D600为0.5左右，加入终浓度为ImMIPTG, 30°C诱导4h ;诱导菌液4°C 12000g离心5min,收集菌体，菌体用IOml Ni柱BindingBuffer (IOmM咪唑，10%甘油，500mM NaCl,Tris20mM,pH8.0)重悬并进行超声波破碎，破碎后4°C 12000g离心30min，收集上清液；将上清液上至用Binding Buffer平衡好的Ni柱，用10 倍体积的 Wash Buffer (25mM 咪唑，10% 甘油，500mM NaCl，Tris20mM，pH8.0)洗脱，然后用Ni柱洗脱缓冲液Elution Buffer (2 00mM咪唑)洗涤Ni柱，分管收集洗脱液；SDS_PAGE检测洗脱液中蛋白分布，合并含单一目的带的洗脱液即可得到重组1-卡拉胶酶。
[0017]可用Bradford法测定目的蛋白浓度，分装后将蛋白冻存于_80°C以备用。
[0018]所述t -卡拉胶重组酶CgiA2_Ce可在降解t -卡拉胶中应用，降解产物为2个1-卡拉胶寡糖，聚合度分别为2-4糖和6-10糖。
[0019]所述降解产物可在制备抗菌剂，抗病毒剂、免疫调节剂、抗氧化剂等中应用，尤其是在用于海水养殖中的抗菌剂，抗病毒剂、免疫调节剂、抗氧化剂等中应用，对虾的存活率可提高20%~30%。
[0020]所述t -卡拉胶酶基因cgiA2_Ce，可通过基因工程技术获得其重组蛋白，该序列编码的蛋白质在制备低聚卡拉胶寡糖，海藻工具酶及海藻多糖结构研究等方面有广泛的应用。
[0021]本发明的1-卡拉胶酶基因cgiA2_Ce编码Cellulophaga sp.KL-A菌株的卡拉胶酶基因，用其生产的重组1-卡拉胶酶温度和PH稳定性好，活性高，能降解卜卡拉胶，降解产物为2个t -卡拉胶寡糖，聚合度分别为2-4糖和6-10糖，能够应用于生产低聚寡糖，本发明的大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)-pET32a-cgiA2_Ce能够大量的表达t -卡拉胶酶CgiA2_Ce，表达水平高，由于产物较单一，便于纯化，减少寡糖纯化的难度。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为降解产物的TLC图(CgiA2_Ce酶解ι -卡拉胶产物TLC分析，15min~24h时间梯度降解)。【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例对发明做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按照常规条件进行，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
[0024]实施例1: t -卡拉胶酶基因cgiA2_Ce的分离
[0025]通过对黄杆菌KL-A进行全基因组测序得到多个卡拉胶酶基因及其基因序列，包括K-、λ-、t -卡拉胶基因，cgiA2_Ce是其中一个^ -卡拉胶酶基因。利用生物学软件Primer5.0设计上游引物(5’ -3’)和下游引物(5’ -3’)以基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR反应组成如下(50 μ L反应体系):上游和下游引物各2 μ L，DNA模板I μ L，10XBuffer5 μ L, dNTP Mix5 μ L, Ex Taq0.5 μ L, ddH2034.5 μ L。反应条件为:94°C预变性5min, 94°C变性 30s, 52.4°C退火 30s, 72°C延伸 lmin20s, 72°C终延伸 5min,共 30 个循环。反应结束后，将PCR产物回收得到t -卡拉胶酶基因cgiA2_Ce。
[0026]实施例2:大肠杆菌克隆载体pGEM-T-cgiA2_Ce的构建
[0027]将cgiA2_Ce与载体pGEM-T连接，采用DNA Ligation Kit连接，连接体系(10 μ L)如下:2XBuffer5yL，DNA片段3yL，pGEM-T载体lyL，T4连接酶lyL，4°C过夜连接。连接液即为pGEM-T-cgiA2_Ce，用于转化大肠杆菌DH5 α。
[0028]实施例3:大肠杆菌重组株DH5 a -PGEM-T_cgiA2_Ce的构建
[0029]加入100 μ L解冻的感受态E.coli DH5 α和10 μ L实施例2得到的连接液至1.5mLEppendorf管中，冰浴30min`，42°C热激90s，冰浴30min，加入LB培养基900 μ L，37°C振荡培养lh，菌液与4 μ L TPTG及40 μ L Χ-gal混合后涂布于含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板上，37°C过夜培养。挑白色单菌落做PCR检测，琼脂糖凝胶电泳中呈现1.5kb特异带者为阳性转化菌落，即含有pGEM-T-cgiA2_Ce的大肠杆菌菌落。
[0030]实施例4:大肠杆菌表达载体pET32a-cgiA2_Ce的构建
[0031]克隆载体和表达载体分别用NcoI和Sal I双酶切，酶切条件如下:
[0032]反应体系1:pGEM-T-cgiA2_Ce 质粒 8 μ L，10XTango4y L, NcoI0.5μ L, SalIl μ L, ddH206.5 μ L 反应体系 2:pET32a 质粒 8 μ L，10XTango4y L, NcoI0.5μ L, Sal
Ilμ L, ddH206.5 μ L
[0033]37°C下酶切3h，电泳后分别回收两个目的片段1.5kb和5.9kb，二者分别cgiA2_Ce和pET32a片段大小相同，用T4连接酶连接，连接条件如下:5.9kb片段4 μ L，1.5kb片段
2μ L7T4连接酶buffer2 μ L，T4连接酶I μ L，ddH2011 μ L。16°C过夜连接即可获得大肠杆菌表达载体pET32a-cgiA2_Ce，用于转化大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0034]实施例5:大肠杆菌重组菌株BL21 (DE3) -pET32a_cgiA2_Ce的构建
[0035]加入100 μ L解冻的感受态BL21 (DE3)和10 μ L实施例5得到的连接液至1.5mlEppendorf管中，冰浴30min，42°C 90s，冰浴2min，加入LB培养基900 μ L, 37°C振荡培养lh，将菌液涂布于含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板上，37 °C培养过夜。挑去白色菌落做PCR检测，琼脂糖凝胶电泳中呈现1.4kb特异条带者为阳性转化菌落，即含有pET32a-cgiA2_Ce的大肠杆菌重组菌株BL21 (DE3)-pET32a-cgiA2_Ce。
[0036]实施例6:重组1-卡拉胶酶的制备
[0037]挑取大肠杆菌重组菌株BL21 (DE3)-pET32a_cgiA2_Ce单克隆于含有浓度为100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜，按1%接种量接种至200mL同样LB液体培养基中，37°C 180rpm振荡培养至OD6tltlS 0.5左右，加入终浓度为ImM IPTG，30°C诱导4h。诱导菌液4°C 12000g离心5min，收集菌体，菌体用IOml Ni柱BindingBuffer (IOmM咪唑，10%甘油，500mM NaCl, Tris20mM, pH8.0)重悬并进行超声波破碎，破碎后4°C 12000g离心30min，收集上清液。将上清液上至用Binding Buffer平衡好的Ni柱，用 10 倍体积的 Wash Buffer (25mM 咪唑，10% 甘油，500mM NaCl, Tris20mM, ρΗ8.0)洗脱，然后用Ni柱洗脱缓冲液Elution Buffer (200mM咪唑)洗涤Ni柱，分管收集洗脱液。SDS-PAGE检测洗脱液中蛋白分布，合并含单一目的带的洗脱液即可得到重组^ -卡拉胶酶。用Bradford法测定目的蛋白浓度,分装后将蛋白冻存于_80°C以备用。
[0038]实施例7:重组酶活性检测及其酶学性质
[0039]将同样大小的圆滤纸片放在2%t -卡拉胶平板上，分别取IOyL未处理的纯化的重组酶和沸水中煮5min的重组酶滴在滤纸片上，30 V放置24h，然后用10%cetylpyridinium chloride (氯化十六烷基氨基吡唳)染色，IOmin观察透明圈。
[0040]用DNS试剂法测得此卡拉胶酶的酶学性质如下:
[0041]1、最适温度为32°C
[0042]2、最适 pH 为 7.5
[0043]3、不同离子对酶活的影响:重金属离子如Fe3+，Mn2+，Cu2+，Ni2+对酶活有明显的抑制作用，Ca2+，Na+有促进作用，其他金属离子如K+，Mg2+对酶活影响不大。
[0044]4、酶比活:在底物浓度为0.25% ι -卡拉胶，ρΗ7.5，30°C下测得酶比活力为183.4U/mg。
[0045]实施例8:表达产物用于制备ι -卡拉胶寡糖
[0046]制备卡拉胶寡糖时，将ι -卡拉胶溶于50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中配成0.5%的溶液，按重组酶体积:反应体系体积0.1-1:1000加入实施例6中所得的重组1-卡拉胶酶，混合均匀后，35°C温浴 30h,反应不同时间(15min, 30min, lh，2h，4h，8h，12h，24h，30h),沸水浴lOmin，终止反应，12000rpm离心lOmin，以去除未酶解的不溶性片段。向上清液加入2倍体积的无水乙醇，离心去除分子量大的组分，其余可溶性组分于40°C旋转蒸发进行浓缩至20mL，然后再加入3倍体积的无水乙醇使低聚糖沉淀，离心收集沉淀物，经脱盐，旋转蒸发浓缩得到降解产物粗品。
[0047]将氯仿，戊醇(或正丁醇)按体积比4:1比例混合，得到混合试剂。将混合试剂与上述卡拉胶寡糖溶液按体积比1: 3混匀，IOOrpm振摇30min, 1000Og离心Imin去除不溶物，经真空冷冻干燥得到卡拉胶寡糖产物。产物即可作为薄层层析的样品。
[0048]薄层层析板使用前置于100°C烘箱中干燥lh。在层析板上距离底部Icm处用铅笔划出底线，将样品用毛细管点于底线上，用吹风机吹干，置于层析缸中展层。展开剂配方为正丁醇:乙醇:水=6: 5: 3(体积比)。待前沿线到达离层析板顶端Icm处时停止展层，烘箱中干燥。然后往层析板上喷洒显色剂(10%浓硫酸，甲醇作溶质)，110°C烘箱显色lOmin。显色结果显示了降解产物随时间的变化。
【权利要求】
1.1 -卡拉胶酶基因cgiA2_Ce,其特征在于是编码Cellulophaga sp.KL-A的卡拉胶酶基因，DNA序列、氨基酸序列如序列表所示。
2.如权利要求1所述1-卡拉胶酶基因cgiA2_Ce，其特征在于使用包含pET-32a表达载体，pET-28a表达载体，pET-24a表达载体，pET_22b表达载体，pGEX_6p表达载体。
3.^ -卡拉胶重组酶CgiA2_Ce，其特征在于使用包含大肠杆菌的表达系统，酿酒酵母的表达系统，枯草芽孢杆菌的表达系统表达。
4.如权利要求1所述^-卡拉胶酶基因cgiA2_Ce的制备方法，其特征在于其具体步骤如下:
挑取大肠杆菌重组菌株BL21 (DE3) -pET32a-cgiA2_Ce单克隆于含有浓度为100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜，按1%接种量接种至200mL同样LB液体培养基中，37°C 180rpm振荡培养至(?6(|(|为0.5，加入终浓度为ImM IPTG，30°C诱导4h ;诱导菌液4°C 12000g离心5min，收集菌体，菌体用IOml Ni柱Binding缓冲液重悬并进行超声波破碎，破碎后4°C 12000g离心30min，收集上清液；将上清液上至用Binding Buffer平衡好的Ni柱，用10倍体积的Wash缓冲液洗脱，然后用Ni柱洗脱缓冲液Elution Buffer洗涤Ni柱，分管收集洗脱液；SDS-PAGE检测洗脱液中蛋白分布，合并含单一目的带的洗脱液即可得到重组1-卡拉胶酶；所述Binding缓冲液为IOmM咪唑，10%甘油，500mM NaCl,Tris20mM, pH8.0 ;所述 Wash 缓冲液为 25mM 咪唑，10% 甘油，500mM NaCl，Tris20mM, pH8.0 ；所述Ni柱洗脱缓冲液为200mM咪唑。
5.如权利要求3所述t-卡拉胶重组酶CgiA2_Ce在降解t -卡拉胶中的应用，降解产物为2个t -卡拉胶寡糖，聚合度分别为2-4糖和6-10糖。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于所述降解产物在制备抗菌剂，抗病毒剂、免疫调节剂、抗氧化剂中应用。
7.如权利要求5所述应用，其特征在于所述降解产物在用于海水养殖中的抗菌剂，抗病毒剂、免疫调节剂、抗氧化剂中应用。
【文档编号】C12R1/01GK103773785SQ201410043784
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月29日 优先权日:2014年1月29日
【发明者】邵宗泽, 单大鹏, 古铮, 李旭, 应见喜 申请人:国家海洋局第三海洋研究所