肽、包含该肽的药物组合物及其用途的制作方法

专利名称：肽、包含该肽的药物组合物及其用途的制作方法
肽、包含该肽的药物组合物及其用途技术领域和
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本发明在其一些实施方式中涉及肽，并且更具体但不排他地，涉及其在抑制胰岛素降解酶(IDE)中的用途。糖尿病是一种综合症，其特征为由激素胰岛素水平不足引起的代谢紊乱和不正常的高血糖(高血糖症)。最常见的糖尿病形式为I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病。 糖尿病常常与引起补偿性口渴和液体摄入增加的过多的排尿量、视力模糊、无法解释的体重减轻、嗜睡以及能量代谢变化相关。自从1921年可医学获得胰岛素，所有类型的胰岛素均是可治疗的。I型糖尿病患者依赖于外源胰岛素(最通常为皮下注射)，因为它们的胰脏(由胰岛)不再产生该激素。II型糖尿病或妊娠糖尿病患者通常具有胰岛素抗性并且需要胰岛素来控制血糖水平 [Vinik 等人，Q004)MedGenMed6 :12]。在正常的主体(即非糖尿病患者)中，升高的胰岛素水平使得葡萄糖吸收并贮存在细胞内，从而减少了糖原向葡萄糖的转化，降低了血糖水平，并由此降低了胰岛素释放。 因此，正常情况下血液葡萄糖水平在进食后会在某种程度上升高并且在一个小时左右回复至正常的“空腹”水平。当用胰岛素(例如合成的人胰岛素或胰岛素类似物)治疗患者时必需确定正确的剂量和正确的给予时间并且试图像在非糖尿病患者中那样达到对血糖的生理调节。然而，用胰岛素治疗糖尿病患者常常远不能达到正常的葡萄糖控制并且维持基础率(basal rate)和给予率(推注率，bolus rate)是胰岛素依赖性糖尿病患者每天必需设法实现的一种持续的平衡作用[Vinik等人，如上文]。此外，由于对体重增加、低血糖、心血管后果的担忧或者由于患者不愿意配合，许多医护人员常常不愿意开胰岛素处方。而且， 持续注射胰岛素增加了胰岛素与抗体结合的风险，这似乎是I型糖尿病患者中无法解释的严重低血糖症的高危因子。胰岛素对葡萄糖、脂质和蛋白质代谢以及细胞生长和分化是关键性的。其主要通过肝脏和肾脏从人体清除，但是大多数其他组织也降解胰岛素。胰岛素降解酶(IDE，胰岛素溶酶)是引起胰岛素降解的主要的酶[Simkin等人，(1949)Arch Biochem 24 =422-428] 0 IDE是位于胞质溶胶、过氧化物酶体、内涵体内和细胞表面的约IlOkDa的巯基锌-金属内肽酶。该酶裂解各种不同序列的小蛋白，其中许多共有形成富含β-片层(pleated sheet)的淀粉样纤维的倾向，所述小蛋白包括淀粉样蛋白(Αβ)、胰岛素、胰高血糖素、胰淀素、 心房利钠因子和降钙素[Simkin等人，如上文]。染色体IOq 的 IDE 区与 II 型糖尿病[DM2，Ghosh 等人，(2000) Am J Hum Genet 67 1174-1185 !Wiltshire 等人，(2002)Am J Hum Genet70 :543-546]和升高的空腹葡萄糖水平[Meigs等人，(2002)Diabetes51 =833-840]遗传学相关。此外IDE+小鼠具有高胰岛素血症和葡萄糖耐受，这些是DM2的特点[Farris等人，(2003) Proc Natl Acad Sci USA100 4162-4167]。该模型证明了引起胰岛素降解的蛋白酶的体内缺乏会响应葡萄糖负荷导致高血糖症(即葡萄糖耐受不良)。研究报告已进一步表明在阿尔茨海默病中IDE在Αβ降解中的作用[Farris等人，如上文]。IDE+模型动物中大脑A β的升高(约10-65% )验证了 IDE在体内A β蛋白质水解中的作用，但是在完整的大脑中很可能存在另外的Αβ清除机制，特别是Αβ 42。 其他蛋白酶(例如，ΝΕΡ，内皮素转化酶)可能参与Αβ清除并且部分补偿IDE功能的缺失。IDE还是介导水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染和细胞间扩散的细胞受体[Li等人， (2006) Cell 127:305-316]。通过SiRNA下调IDE或者用抗体、可溶性IDE蛋白(从肝脏提取)或者杆菌肽阻断IDE可抑制VZV感染[Li等人，如上文]。IDE与病毒感染必需的糖蛋白E (gE)通过该糖蛋白的胞外结构域相互作用，然而，IED不降解VZV。已解析的IDE晶体结构[Shen等人，(2006) Nature 443 :870-874]显示IDE的氨基端和羧基端结构域(分别为IDE-N和IDE-C)形成包含锌结合活性位点的蛋白水解腔，其正好足够大以包裹胰岛素。IDE-N和IDE-C之间的大面积接触保持底物不能进入IDE降解腔。IDE结构域的复位(从IED-闭合转变成其活性形式IDE-开放)使得底物能够进入催化腔(图1)。IDE对多种生理学底物的活性可由该酶的详细的晶体结构得到部分解释。该结构数据显示IED的形状类似蛤壳，由通过柔性铰链连接的两个碗状半体组成，这使得该酶能够以两种构象存在，即闭合和开放。在底物的催化过程中，当IDE结合、催化然后释放其底物时，该酶分别从开放结构转化成闭合构型并且回复至开放结构。两个IDE半体之间延长的氢键形成了充当将酶保持于闭合状态的“门闩”。促进开放构象的突变已被证明可将该蛋白质裂解底物的效率提高30-40倍[Sien等人，如上文]。已指出限速步骤是该酶重新开放并且接着夹住新的底物的速度而不是将某些物质降解(chew)所需要的时间。第20030104981号美国专利申请公开了用于治疗糖尿病的新的人胰岛素类似物， 该类似物的特征在于对胰岛素降解酶(IDE)具有增强的稳定性以及达到比天然胰岛素更长的寿命。第20030104981号美国专利申请教导的胰岛素类似物的结构特征为除去了人胰岛素B-链中的B^-B30并且在BIO、B14和B17具有至少一个特定的置换。第7，108，972号美国专利公开了多核苷酸和多肽以及它们的用途，包括两个编码胰岛素样蛋白质的N0V3核酸序列。根据第7，108，972号美国专利，这些胰岛素样蛋白质可用于诊断和治疗包括糖尿病在内的各种疾病和病症。

发明内容
根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了包含长度不大于25个氨基酸的氨基酸序列的分离的肽在制备经鉴定用于治疗选自糖尿病、肥胖症、高血糖症、视网膜损伤、 肾衰竭、神经损伤、微血管损伤以及水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染的疾病的药物中的用途，所述氨基酸序列包含至少一个天冬氨酸(aspartate)或其同系物，所述肽具有胰岛素降解酶(IDE)抑制活性。根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了包含长度不大于25个氨基酸的氨基酸序列的分离的肽在治疗选自糖尿病、肥胖症、高血糖症、视网膜损伤、肾衰竭、神经损伤、微血管损伤以及水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染的疾病中的用途，所述氨基酸序列包含至少一个天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰岛素降解酶(IDE)抑制活性。根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了在需要其的主体中治疗选自糖尿病、肥胖症、高血糖症、视网膜损伤、肾衰竭、神经损伤、微血管损伤以及水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染的疾病的方法，所述方法包括向主体给予包含长度不大于25个氨基酸的氨基酸序列的分离的肽，所述氨基酸序列包含至少一个天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰岛素降解酶(IDE)抑制活性。根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了包含长度不大于25个氨基酸的氨基酸序列的分离的肽，所述氨基酸序列包含至少一个天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰岛素降解酶(IDE)抑制活性。根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了包含作为活性成分的权利要求4-18 中任一项的分离的肽和药学可接受载体的药物组合物。根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了制品，其包含权利要求4-18中任一项的分离的肽和胰岛素，它们各自包装于包装材料中并且在包装材料内或包装材料上通过印刷指明用于糖尿病治疗。根据本发明的一些实施方式的一方面，提供了鉴定具有胰岛素降解酶(IDE)抑制活性的肽的方法，所述方法包括于存在或不存在权利要求4-18中任一项的肽的条件下使 IDE与IDE的报告子底物接触，其中在所述肽存在下报告子活性的降低可指示具有IDE抑制活性的肽。根据本发明的一些实施方式。所述氨基酸序列选自SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ IDNO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO 64,SEQ IDNO 65,SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 69、SEQ ID NO 70,SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、SEQ IDNO :74、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :79、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :82、SEQ IDNO :83、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO 85 以及 SEQ ID NO 86 构成的组。根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸序列如SEQ ID NO 19中所列。根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸序列包含在至少一个天冬氨酸或其同系物和所述氨基酸序列的N-端序列之间添加柔性(flexibility)的基团。根据本发明的一些实施方式，所述添加柔性的基团包括氨基酸序列。根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸序列包括SEQ ID N0:13。根据本发明的一些实施方式，所述N-端序列包含IDE结合序列。根据本发明的一些实施方式，所述氨基酸序列包含IDE结合序列。根据本发明的一些实施方式，所述IDE结合序列选自SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 24 和 SEQ ID NO 25 构成的组。根据本发明的一些实施方式，所述至少一个天冬氨酸或其同系物包括两个天冬氨酸或其同系物。根据本发明的一些实施方式，所述两个天冬氨酸或其同系物在所述肽中连续定位。根据本发明的一些实施方式，所述天冬氨酸同系物是结构同系物。
根据本发明的一些实施方式，所述结构同系物包括天冬酰胺。根据本发明的一些实施方式，所述天冬氨酸同系物是带负电荷的氨基酸。根据本发明的一些实施方式，所述带负电荷的氨基酸是谷氨酸。根据本发明的一些实施方式，所述给予(给药)是鼻内给予。
根据本发明的一些实施方式，所述治疗有效量使得给予后主体的血胰岛素水平升
尚ο根据本发明的一些实施方式，所述治疗有效量使得给予后主体的血胰岛素生长因子(IGFl)水平升高。根据本发明的一些实施方式，所述治疗有效量使得给予后主体的T淋巴细胞的 IL-17分泌减少。根据本发明的一些实施方式，所述治疗有效量使得给予后主体的T淋巴细胞的 IFN-Y分泌减少。根据本发明的一些实施方式，所述治疗有效量为0. 1-10μ g/kg体重。除非另外定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述那些相似或相等的方法和材料可用于实施或检测本发明的实施方式，但是仍在下文描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，以包括定义在内的本专利说明书为准。此外，材料、方法和实施例仅为示例性的并且不旨在具有必然的限制性。


仅通过例举方式，参照附图在本文中描述了本发明的一些实施方式。现详细参照具体的附图，应强调所显示的细节仅为示例性的并且用于例示性讨论本发明的实施方式。 就此而言，说明书连同附图可使本领域技术人员明了如何实施本发明的实施方式。在附图中图1描绘了抑制胰岛素降解酶(IDE)活性的模型。该图示出了描绘IDE结合至本发明抑制剂(例如ADT-21)的模型。IDE的开放状态(IDE-开放-IDE-°)使得底物能够进入催化腔，然而，当抑制剂与酶结合时其抑制IDE向其开放状态的构象变化并且保持其处于闭合状态。图2描绘了 VZV IDE结合蛋白与其他已知的IDE底物在催化裂隙(催化部位， catalytic cleft)结合区段的多序列比对(MSA)。该MSA显示了底物之间的相似特征并且指明VZV gE(24-50, SEQ ID NO 5)氨基酸为可能有助于IDE结合的候选物。应注意的是， MSA还指明了 VZV gE主要切割(裂解，cleavage)位点的重要特征(DD重复，SEQ ID NO: 26)。图3描绘了靶向IDE催化裂隙的具有潜在抑制性质的短肽的设计。图4描绘了不同IDE底物的N端结合区段。应注意的是，MSA显示Asn 3在胰岛素B链、胰淀素(Amylin)和VZV gE中高度保守。图5描绘了具有共同作用(辅助作用，co-effect)的IDE抑制剂的设计靴向IDE N-端结合区段和催化裂隙。应注意的是，这些IDE抑制剂还包含接头(连接子，linker)序列。图6是描绘ADT-21 (SEQ ID NO 9)对IDE活性的剂量依赖性抑制的条形图。为了测量IDE活性，用靶酶(IDE)包被ELISA板，然后将板与选择的合成肽候选物温育并且对照无候选肽的孔测量酶活性。使用InnoZyme 胰岛素溶酶Gnsulysin)/IDE试剂盒测量IDE 活性(IC50 = IOOnM)，***p < 0. 0001 ；**p < 0. 001。应注意的是，ADT-21 以剂量依赖方式抑制IDE活性。图7描绘了 ADT21对IDE降解胰岛素的抑制。在有或无IDE(1. 14nM)的条件下将分离自牛胰脏的胰岛素(0. 87nM) (SIGMA)和ADT21 (SEQ IDNO :19,0. 2nM)温育。结果表示三次重复实验*P <0.05。图8描绘了 NOD小鼠中的疾病进展。NOD小鼠模型被用作胰岛素依赖型糖尿病 (IDDM)的模型。将12周龄的小鼠分成2个治疗组(η = 10-12)。一组每隔一天接受鼻内 10 μ 1 ADT21 (3. 76 μ g/kg)。第二组接受PBS (对照组)。使用葡萄糖试纸监测小鼠血糖水平*ρ < 0. 05。图9描绘了 ADT21治疗后NOD小鼠中糖尿病患者百分数降低。用鼻内10 μ 1 ADT21(治疗)或PBS (对照)治疗12周龄NOD小鼠[n = 10-12]并且使用葡萄糖试纸每周监测血糖水平。中度糖尿和高于250mg/dl*p < 0. 05的非空腹血糖表明糖尿病发病。图10描绘了 NOD小鼠的体重分布。用10 μ 1 ADT21 (治疗)或PBS (对照)治疗 12周龄NOD小鼠并且每周监测体重变化。图11描绘了与对照小鼠相比ADT21治疗小鼠中更高的血胰岛素水平。在第30周与未治疗的NOD小鼠(对照)和非糖尿病小鼠[n = 6]相比监测(使用HTRF hsulin assay)用10 μ 1 ADT21治疗的NOD小鼠的血胰岛素水平*ρ < 0. 05，< 0. 01。图12A-C描绘了胰岛炎(insulitis)的组织学分析。在第30周龄时，将用或未用 10 μ 1 ADT21治疗的NOD小鼠处死；分离它们的胰腺并且用Η&Ε染色法染色。图12Α-Β显示取自对照和ADT-21治疗的NOD小鼠的胰腺切片。这些图示出了胰岛(放大率Χ40)；图 12C是图解获自ADT-21治疗的和未治疗的小鼠(对照)[η = 6]的胰腺的胰岛炎评分(组织学评分)的条形图*P = 0. 001。图13描绘了与对照小鼠相比ADT-21治疗小鼠中更高的血IGFl水平。在第30周使用AssayMax小鼠IGFl试剂盒监测NOD小鼠的血胰岛素生长因子1 (IGFl)水平。[n = 6]*ρ < 0. 05。图14Α-Β描绘了获自ADT-21治疗小鼠的细胞促炎性细胞因子IFN- γ和IL-17的分泌减少。在30周龄时将未治疗的或用10 μ 1 ADT21治疗的NOD小鼠(n = 6-7)处死并且分离它们的脾细胞。在96-孔板中以1x106个细胞/孔的浓度培养脾细胞并且与10 μ g/ml 胰岛素温育。培养4 后收集上清用于细胞因子测量。通过ELISA测量IFN-γ (FIG. 14A) 或 IL-17(FIG. 14B)的分泌，*p < 0. 05。图15A-B描绘了与抗原递呈细胞和ADT21共培养后⑶4+细胞的促炎性细胞因子 IFN- γ和IL-17的分泌减少。用胰岛素免疫NOD小鼠后，从淋巴样组织分离⑶4+T-细胞。 然后将分离的CD4+T-细胞与分离自未免疫NOD小鼠的脾细胞在胰岛素存在下、在有或无 ADT21的条件下共培养。通过ELISA测量IFN-y (FIG. 15A)或IL-17 (FIG. 15B)的分泌[η =4]，*ρ < 0· 05。图16Α-Β描绘了 IDE-/-小鼠中促炎性细胞因子的产生减少。用胰岛素免疫WT和IDE-/-小鼠。分离这些小鼠的脾并且测量免疫应答的水平。通过ELISA测量 IFN- y (FIG. 16A)或 IL-17 (FIG. 16B)的分泌[n = 4]，*p < 0. 05。
具体实施例方式
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本发明在其一些实施方式中涉及肽，并且更具体但不排他地，涉及其在抑制胰岛素降解酶(IDE)中的用途。参照附图和以下描述，可以更好地理解本发明的原理和操作。在详细阐述本发明的至少一个实施方式之前，应理解本发明的应用不一定受限于下文说明中所列或实施例中所举例说明的细节。本发明还有其他实施方式或能够以各种方式实践或实施。而且，应理解本文使用的表达方式和术语是用于描述目的并且不应认为其具有限制性。在实施本发明时，本发明人已鉴定了特异结合胰岛素降解酶(IDE)(例如GenBank 登录号NM_004969和NP_004960中所列)并且抑制它们的酶活性的新肽。这些肽可能结合至IDE的催化裂隙但是抑制其催化活性，并且因此可用作强效的IDE抑制剂并加工 (processing)其天然底物[例如，胰岛素B链和水痘-带状疱疹病毒(VZV)]。如下文和之后的实施例部分所示，本发明人通过多序列比对(MSA)出乎意料地鉴定出VZV糖蛋白E (gE)氨基酸序列(例如GenBank登录号NP_040189中所列)，其为VZV特有的，特异结合IDE催化裂隙并且阻止酶裂解。该氨基酸序列包含两个重复的氨基酸天冬氨酸(D)(Aspl3、Aspl4，见图2)。此外，本发明人已鉴定出各种IDE底物的N-端结合区段 (图4)。综合而言，鉴定这些序列使能够生成特异结合IDE并且可能抑制其活化的新肽(SEQ ID NO 14-18和19-23，分别为图3和5)。为了提高所述肽的构象柔性(conformational flexibility)并且使能够增加与IDE的结合，本发明人还向本发明的新肽加入了添加柔性的部分(moiety) (SEQ ID N0:13)(图3)。此外，本发明人已证明这些新肽中的一种 ADT-21 (SEQ ID NO 19)包含特异的IDE抑制性质(图6)和减少的胰岛素降解(图7)。还证明当鼻内给予时ADT-21可缓解非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的I型糖尿病(图8_10)并且增加血胰岛素水平(图11)，因此使血糖的生理调节成为可能。此外，已证明ADT-21可增加 NOD小鼠血清中的IGF-I水平(图13)并且降低这些小鼠中促炎性细胞因子的产生(IFN-γ 和IL-17分泌，分别为图14Α-Β)。此外，已证明ADT21降低对胰岛素的⑶4+Τ细胞炎症反应 (图 15Α-Β)。因此，根据本发明的一方面，提供了包含长度不大于25个氨基酸的氨基酸序列的分离的肽，所述氨基酸序列包含至少一个天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰岛素降解酶 (IDE)抑制活性。本文使用的术语“肽”包括天然肽(降解产物、合成肽或重组肽)和拟肽(通常为合成肽)以及为肽类似物的类肽(P印toid)和半类肽(semip印toid)，其具有例如至少一个使得所述肽在体内更稳定或者渗透细胞的能力更强的修饰(例如合成的，即非天然的)。 此类修饰进一步描述于下文。所述肽至少为如下文进一步描述的二肽。本文使用的术语“分离的”指可从其天然存在的环境中分离的肽的均质制剂。根据本发明一实施方式，所述肽的长度不大于2个氨基酸，长度不大于4个氨基酸，长度不大于6个氨基酸，长度不大于8个氨基酸，长度不大于10个氨基酸，长度不大于 15个氨基酸，长度不大于20个氨基酸，或者长度不大于25个氨基酸，应理解本发明的肽包含胰岛素降解酶(IDE)抑制活性。本文使用的术语“胰岛素降解酶(IDE) ”指胰岛素溶酶或胰岛素蛋白酶，其为参与包括胰岛素和胰高血糖素在内的多个短多肽的细胞加工的M16A金属蛋白酶亚家族的大锌结合蛋白酶(例如,如GenBank登录号NM_004969和NP_004960中所列)。本文使用的术语“IDE抑制活性”指特异下调IDE的酶活性。例如，测定ADT-21对 IDE的IC50的范围为10-200nM。根据示例性实施方式，本发明的肽能够将IDE的酶活性下调至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、 至少70%、至少80%、至少90%或至少100%。应理解本发明的肽的IDE抑制活性导致T淋巴细胞的IFN- γ和IL-17分泌减少 (如实施例7所描绘)。此外，本发明的肽的IDE抑制活性导致糖尿病进展延迟(如实施例 4所描绘)并且阻碍对胰岛素的自身免疫应答(实施例8)。应理解IDE是包含用于底物结合的胞外结构域的细胞酶。此外。IDE还可从细胞分泌并且因此在胞外结合其底物[Li等人，(2006)Celll27 :305-316 Jhen等人，(2006) Nature 443 :870-874]。因此，本发明人设想，通过在细胞表面或胞外接触，用本发明的肽抑制 IDE。如上文所述，本发明的肽包含至少一个天冬氨酸或其同系物。本文使用的术语“天冬氨酸或其同系物”指氨基酸天冬氨酸或与其具有结构相似性的氨基酸。根据示例性实施方式，所述结构同系物为天冬酰胺。根据其他示例性实施方式，所述同系物是带负电荷的氨基酸，例如但不限于谷氨酸。根据本发明的示例性实施方式，所述肽包含一个、两个或更多个天冬氨酸或其同系物。根据一示例性实施方式，所述肽包含两个天冬氨酸或其同系物。根据本发明这一方面的一实施方式，所述天冬氨酸或其同系物在所述肽中的位置是连续的。本发明的一示例性肽如SEQ ID NO 26中所列。应理解所述天冬氨酸或其类似物可位于肽内的任何位置，例如位于肽的N端、肽的C-端或肽的IDE催化裂隙结合位点内，从而使本发明的肽能够特异结合并且抑制IDE。 因此，本发明的肽的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO 14,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16,SEQ ID NO 17, SEQ IDNO :18、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO 63、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO :65 禾口 SEQ ID NO 66 中所列。根据本发明的实施方式，所述肽可能包含至少一个IDE结合序列(例如，1个、2 个、3 个或更多个)，例如 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQID NO :8、SEQ ID NO 24 或 SEQ ID N0:25中所列。该序列可位于肽内的任何位置，例如肽的N-端或肽的C-端。应理解本发明的肽还包含添加柔性的部分。该部分可向肽添加柔性并且使其具有构象柔性用于增加对IDE的结合和抑制。本发明教导的可添加柔性的部分可包括肽部分 (peptide moiety)或化学部分(chemical moiety)，例如有机聚合物。应理解该添加柔性的部分可包含共价键(例如肽键)或非共价键。添加本发明柔性的部分的示例性化学交联法描述于下文巯基-氨基交联(Thiol-amine crosslinking)在该路线中，通常通过两步或三步反应过程使肽的氨基基团与巯基基团间接结合。巯基的高反应性以及它们在大多数肽中的相对稀少性使得巯基成为受控化学交联的理想靶位。可使用包括SPDP在内的数种巯基化方法之一将巯基基团引入肽中。然后使用异双功能基交联剂(heterobifunctional crosslinking reagent)使含巯基的生物分子与含氨基的生物分子反应。
氨基-氨基交联可使用包括但不限于戊二醛、二(亚胺酯)、二(琥珀酰亚胺酯)、二异氰酸酯和二酰氯(diacid chloride)的氨基-氨基交联剂，通过本领域技术人员已知的方法实现部分单元(moiety element)的结合。碳二亚胺(carbodiimide)结合可使用脱水剂例如碳二亚胺，通过本领域技术人员已知的方法，实现部分单元的结合。最优选在4-二甲基氨基吡啶存在下使用碳二亚胺。如本领域技术人员所熟知，碳二亚胺结合可用于在一个肽的羧基和第二个肽的羟基(导致形成酯键)，或第二个肽的氨基基团(导致形成酰胺键)或者第二个肽的巯基(导致形成硫酯键)之间形成共价键。相似的，碳二亚胺偶联可用于在第一个肽的碳基团和第二个肽的羟基、氨基或巯基基团之间形成类似的共价键。一般性参见，J.March，Advanced Organic Chemistry Reaction' s, Mechanism, and Structure,H 349-50&372—74 M ( H 3 片反)，1985。添加本发明柔性的示例性部分包括氨基酸序列，例如SEQ ID NO 13中所列。应理解添加柔性的部分的氨基酸序列可位于肽内的任何位置以使例如天冬氨酸或其类似物和本发明的N-端序列之间的构象柔性成为可能(如图5所示)。因此，根据本发明另一实施方式，本发明的肽的氨基酸序列如SEQ IDNO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :68、 SEQ ID NO 69,SEQ ID NO 70、SEQ IDNO :71、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO :74、 SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :79、SEQ IDNO 80,SEQ ID N0:81、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO :85 和 SEQ ID N0:86中所列。根据一示例性实施方式，所述氨基酸序如SEQ ID NO :19中所列。如所述，本发明的肽可包含修饰。此类修饰包括但不限于N端修饰、C端修饰、包括但不限于 CH2-NH、CH2-S、CH2-S = 0、0 = C-NH、CH2-0、CH2_CH2、S = C_NH、CH = CH ^ CF = CH的肽键修饰、骨架修饰和残基修饰。制备拟肽化合物的方法为本领域所熟知，并且详细说明于例如 Quantitative Drug Design，C. A. Ramsden Gd.，章节 17. 2，F. Choplin Pergamon Press (1992)中，其以全文并入本文中以供参考。该方面的另外的细节提供于下文。肽内的肽键(-C0-NH-)可被以下键置换，例如N-甲基化键(_N (CH3) -C0-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-C0-CH2-)、其中R为诸如甲基的烷基的α-氮杂(aza)键(-NH-N(R)-CO-)、卡巴(carba)键(-CH2-NH-)、羟乙烯(hydroxyethylene) 键(-CH(0H)-CH2-)、硫代酰胺(thioamide)键(-CS-NH-)、烯烃双键(-CH = CH-)、逆酰胺 (retro amide)键(-NH-C0-)、其中R为天然存在于碳原子上的“正常”侧链的肽衍生物 (-N(R) -CH2-C0-)。这些修饰可出现在沿着肽链的任何键上并且甚至同时出现在数个(2- 键上。可使用保守置换(例如上文对天冬氨酸或其同系物所述)。天然芳香族氨基酸 Trp,Tyr和Phe可被合成的非天然酸，例如TIC、萘基丙氨酸(Nol) ,Phe的环甲基化衍生物、 Phe的卤化衍生物或ο-甲基-Tyr置换。除上文所述，本发明的肽还可包含一个或多个被修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。术语“一种氨基酸”或“多种氨基酸”应理解为包括20种天然氨基酸；这些氨基酸通常在体内被翻译后修饰，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他非天然氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。 此外，术语“氨基酸”包括D-和L-氨基酸二者。下文表1和2列出了可与本发明使用的天然氨基酸(表1)和非天然或被修饰的氨基酸(表2)表 权利要求
1.包含长度不大于25个氨基酸的氨基酸序列的分离的肽在制备经鉴定用于治疗选自糖尿病、肥胖症、高血糖症、视网膜损伤、肾衰竭、神经损伤、微血管损伤以及水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染所构成的组的疾病的药物中的用途，所述氨基酸序列包含至少一个天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰岛素降解酶(IDE)抑制活性。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述至少一个天冬氨酸或其同系物包括两个天冬氨酸或其同系物。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述两个天冬氨酸或其同系物在所述肽中连续定位。
4.包含长度不大于25个氨基酸的氨基酸序列的分离的肽在治疗选自糖尿病、肥胖症、高血糖症、视网膜损伤、肾衰竭、神经损伤、微血管损伤以及水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染所构成的组的疾病中的用途，所述氨基酸序列包含至少一个天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰岛素降解酶(IDE)抑制活性。
5.一种在需要其的主体中治疗选自糖尿病、肥胖症、高血糖症、视网膜损伤、肾衰竭、神经损伤、微血管损伤以及水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染所构成的组的疾病的方法，所述方法包括向所述主体给予治疗有效量的包含长度不大于25个氨基酸的氨基酸序列的分离的肽，所述氨基酸序列包含至少一个天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰岛素降解酶(IDE)抑制活性。
6.一种分离的肽，包含长度不大于25个氨基酸的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含至少一个天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰岛素降解酶(IDE)抑制活性。
7.根据权利要求1、4、5或6所述的用途、方法或分离的肽，其中，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :26、SEQ IDNO :62, SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQID NO :68, SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :74,SEQ ID NO :75,SEQ ID NO :76,SEQ ID NO :77,SEQ ID NO :78,SEQ ID NO:79、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :84、SEQ IDNO 85以及SEQ ID NO :86构成的组中。
8.根据权利要求1、4、5或6所述的用途、方法或分离的肽，其中，所述氨基酸序列如SEQID NO 19中所示。
9.根据权利要求1、4、5或6所述的用途、方法或分离的肽，其中，所述氨基酸序列包含在所述至少一个天冬氨酸或其同系物和所述氨基酸序列的N端序列之间添加柔性的部分。
10.根据权利要求9所述的用途、方法或分离的肽，其中，所述添加柔性的部分包括氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的用途、方法或分离的肽，其中，所述氨基酸序列包括SEQIDNO :13ο
12.根据权利要求9所述的用途、方法或分离的肽，其中，所述N-端序列包含IDE结合序列。
13.根据权利要求1、4、5或6所述的用途、方法或分离的肽，其中，所述氨基酸序列包含IDE结合序列。
14.根据权利要求12或13所述的用途、方法或分离的肽，其中，所述IDE结合序列选自 SEQ ID NO 6, SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :24 禾口 SEQ ID NO :25 所构成的组中。
15.根据权利要求4、5或6所述的用途、方法或分离的肽，其中，所述至少一个天冬氨酸或其同系物包括两个天冬氨酸或其同系物。
16.根据权利要求15所述的用途、方法或分离的肽，其中，所述两个天冬氨酸或其同系物在所述肽中连续定位。
17.根据权利要求1、4、5或6所述的用途、方法或分离的肽，其中，所述天冬氨酸的所述同系物是结构同系物。
18.根据权利要求17所述的用途、方法或分离的肽，其中，所述结构同系物包括天冬酰胺。
19.根据权利要求1、4、5或6所述的用途、方法或分离的肽，其中，所述天冬氨酸的所述同系物是带负电荷的氨基酸。
20.根据权利要求19所述的用途、方法或分离的肽，其中，所述带负电荷的氨基酸是谷氨酸。
21.一种药物组合物，包含权利要求6-20中任一项所述的分离的肽作为活性成分、以及药学可接受的载体。
22.—种制品，包含权利要求6-20中任一项所述的分离的肽和胰岛素，所述分离的肽和胰岛素各自被包装于包装材料中，并且在所述包装材料内或所述包装材料上通过印刷被指明用于糖尿病的治疗。
23.一种鉴定具有胰岛素降解酶(IDE)抑制活性的肽的方法，所述方法包括在权利要求6-20中任一项所述的肽存在或不存在的情况下，使IDE与所述IDE的报告子底物接触， 其中，在所述肽存在的情况下，所述报告子的活性降低指示为具有IDE抑制活性的肽。
24.根据权利要求5所述的方法，其中，所述给予为鼻内给予。
25.根据权利要求5所述的方法，其中，所述治疗有效量在所述给予后使得所述主体的血胰岛素水平升高。
26.根据权利要求5所述的方法，其中，所述治疗有效量在所述给予后使得所述主体的血胰岛素生长因子I(IGFl)水平升高。
27.根据权利要求5所述的方法，其中，所述治疗有效量在所述给予后使得所述主体的 T淋巴细胞分泌IL-17减少。
28.根据权利要求5所述的方法，其中，所述治疗有效量在所述给予后使得所述主体的 T淋巴细胞分泌IFN-Y减少。
29.根据权利要求5所述的方法，其中，所述治疗有效量是0.l-10yg/kg体重。
全文摘要
本发明披露了包含长度不大于25个氨基酸的氨基酸序列的分离的肽在制备经鉴定用于治疗选自糖尿病、肥胖症、高血糖症、视网膜损伤、肾衰竭、神经损伤、微血管损伤以及水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染构成的组中的疾病的药物中的用途，所述氨基酸序列包含至少一个天冬氨酸或其同系物，所述肽具有胰岛素降解酶(IDE)抑制活性。
文档编号A61P3/12GK102369015SQ201080014546
公开日2012年3月7日 申请日期2010年2月2日 优先权日2009年2月2日
发明者丹·弗雷克尔, 塔利·本罗曼诺, 诺菲特·博雷恩施泰因, 阿迪·科佩勒维奇, 韦罗尼卡·里夫什茨 申请人:雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司