一种制备龟蛋白多肽的方法
【专利摘要】本发明公开了一种龟板中蛋白多肽制备方法及应用。本发明具体步骤包括：龟板粉碎过50目筛，将脱钙剂溶液与所述龟细粉混合并充分反应，接着加入NaOH溶液，充分反应后得到反应液；将反应液离心后保留沉淀，所述沉淀清洗干净后得到脱钙后的龟细粉；将双蒸水与脱钙后的龟细粉混合，沸煮后得到龟蛋白溶出液；以及向龟蛋白溶出液中加入蛋白酶，充分反应后得到龟蛋白多肽该方法省时省力，能够简单、快速、高效地进行工业化生产，经过中试试验，其工艺参数可过渡到产业化。
【专利说明】
-种制备龟蛋白多化的方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种制备龟蛋白多肤的方法。
【背景技术】
[0002] 龟板，即龟甲，为龟科动物乌龟的背甲和腹甲，具有益肾健骨、滋阴潜阳、固精止 血、补血养屯、等功效，为常用名贵滋补药材之一。古代名方如补肾丸、全鹿大补丸、定坤丸等 中成药均含有龟甲，而且是粉碎成细粉入药。从战国时代的《山海经》到《神龙本草经》到《草 本纲目》再到现代的《药典》均记载了龟的食用和药用功效。龟甲富含多种氨基酸、蛋白质、 巧及多种有益微量元素，因此也常用于功能食品及药膳中。
[0003] 生物活性多肤是指能够调节生物机体的生命活动或具有某些生理活性作用（如激 素作用、免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等）的一类小分子活性多肤的总称，运些物质广泛存在于 动物、植物及微生物中。因此，生物活性多肤是筛选药物、制备疫苗和食品添加剂的天然资 源宝库。
[0004] 生物活性肤的结构可W从简单的二肤到较大分子的多肤。由2到10个氨基酸通过 肤键形成的直链肤称为寡肤或小肤；由肤键结合起来的多于10个氨基酸的聚合体则称为多 肤。近年来，科学家经研究发现，蛋白质经消化道酶促水解后主要W小肤或多肤的形式在肠 道中的吸收率高于蛋白质和氨基酸，且多肤具有促进脂质代谢、降低胆固醇、促进矿物质吸 收和促进机体免疫等生理功能，具有较好的酸、热稳定性和水溶性和良好的生理活性。因 此，采用酶解技术将龟甲蛋白水解成多肤，可有效提高龟甲蛋白质的利用率，增加龟甲产品 的附加值，开发出深加工龟甲蛋白产品。
[0005] 生物多肤主要有四种来源，分别为蛋白酶解多肤、微生物发酵代谢多肤、天然活性 多肤及化学合成多肤。其中酶解法不仅产量大、成本低、反应过程不会产生有害物质，符合 "天然、营养、安全"的食品发展潮流，所W成为目前主要的多肤生成方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提出一种从龟板中简单、高效制备龟板蛋白多肤的方法。
[0007] 为了实现运一目的，本发明所采取的技术方案是:一种龟蛋白多肤的制备方法，包 括如下步骤:取干燥龟板粉碎后过筛得到龟细粉;按照固液比为1:2~1:10将脱巧剂溶液与 所述龟细粉混合并充分反应，接着加入NaO田容液，充分反应后得到反应液;将反应液离屯、后 保留沉淀，沉淀清洗干净后得到脱巧后的龟细粉;按照固液比为1:5~1:20将双蒸水与脱巧 后的龟细粉混合，沸煮化~化后得到龟蛋白溶出液；W及按照5000U~30000U的酶量向所述 龟蛋白溶出液中加入蛋白酶，充分反应后得到龟蛋白多肤。
[000引进一步地，脱巧剂为肥1或邸TA。
[0009] 进一步地，脱巧剂为邸TA,所述邸TA的浓度为0.1~0.75mol/L。
[0010] 进一步地，脱巧剂溶液与所述龟细粉混合后进行振摇，使其充分反应，振摇时间为 1~細。
[0011] 进一步地，在脱巧剂溶液与所述龟细粉充分反应后加入化OH进行振摇，使其充分 反应，，NaOH的浓度为Imol/L，振摇时间为6~24H。
[0012] 进一步地，将反应液离屯、所使用的转速是1200化pm。
[0013] 进一步地，将沉淀清洗干净后得到脱巧后的龟细粉的方法是使用去离子水清洗沉 淀2次。
[0014] 进一步地，脱巧后的龟细粉按照固液比1:15加入去离子水，沸煮6个小时。
[0015] 进一步地，蛋白酶为膜蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶 中的一种。
[0016] 进一步地，蛋白酶为中性蛋白酶，酶量为10000~30000U，酶解时间为6~24h。
[0017] 本发明用脱巧剂对龟粉进行前处理后，龟蛋白溶出率比未脱巧处理增加了 6.8倍， 脱巧煮沸处理后龟蛋白溶出率比未处理的增加了 34.3倍。经过脱巧、沸煮后，直接加入蛋白 酶酶解龟蛋白溶出液，水解度到达了 13.62%，蛋白多肤得率为9.64%，该方法简单高效，能 够快速实现产业化。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明一种龟甲蛋白多肤制备方法与其他处理条件龟板粉的蛋白溶出率对 比图；
[0019] 图2是本发明一种龟甲蛋白多肤制备方法的不同脱巧剂的脱巧效率对比图；
[0020] 图3是本发明一种龟甲蛋白多肤制备方法的不同邸TA浓度的脱巧效率对比图；
[0021] 图4是本发明一种龟甲蛋白多肤制备方法的不同固液比的脱巧效率对比图；
[0022] 图5是本发明一种龟甲蛋白多肤制备方法的不同振摇时间的巧沉淀含重对比图；
[0023] 图6是本发明一种龟甲蛋白多肤制备方法的不同沸煮时间的龟粉蛋白溶出率比较 图；
[0024] 图7是本发明一种龟甲蛋白多肤制备方法的不同固液比的脱巧龟粉沸煮猴蛋白溶 出量对比图；
[0025] 图8是本发明一种龟甲蛋白多肤制备方法的不同蛋白酶水解龟甲蛋白液的水解度 对比图；
[0026] 图9是本发明一种龟甲蛋白多肤制备方法的不同酶用量的酶解水解度对比图；
[0027] 图10是本发明一种龟甲蛋白多肤制备方法的不同酶解时间的酶解水解度对比图；
[0028] 图11是本发明一种龟甲蛋白多肤制备方法的不同底物浓度的酶解水解度对比图；
[0029] 图12是本发明一种龟甲蛋白多肤制备方法的不同pH值的酶解水解度对比图；
[0030] 图13是本发明一种龟甲蛋白多肤制备方法的不同溫度条件的酶解水解度对比图。
【具体实施方式】
[0031] W下实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精 神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0032] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0033] 实施例1
[0034] -种制备龟蛋白多肤的方法，包括如下步骤：
[0035] (I)取干燥龟板粉碎成粗粉，经50目筛得龟细粉；
[0036] (2)称取步骤（1)中所得的5g龟细粉，加入IOml的0.75mol/L的抓TA进行混合，振摇 化，加入Imol/L NaOH继续振摇化，得到反应液；
[0037] (3)在常溫下使用120(K)rpm离屯、步骤(2)所得的反应液，去上清，使用去离子水清 洗沉淀2次后离屯、去上清得脱巧后的龟细粉；
[0038] (4)步骤（3)中所得的脱巧龟细粉加入25ml双蒸水，沸煮1个小时，得龟蛋白溶出 液；
[0039] (5)按照20000U的酶量在步骤(4)所得的龟蛋白溶出液中，加入膜蛋白酶酶解龟胶 原蛋白溶液化，获得龟蛋白多肤。
[0040] 实施例2
[0041] -种制备龟蛋白多肤的方法，包括如下步骤：
[0042] (1)取干燥龟板粉碎成粗粉，经50目筛得龟细粉；
[0043] (2)称取步骤（1)中所得的5g龟细粉，加入50mol/L的0.5M的抓TA进行混合，振摇 化，加入Imol/L NaOH继续振摇2地，得到反应液；
[0044] (3)在常溫下使用120(K)rpm离屯、步骤(2)所得的反应液，去上清，使用去离子水清 洗沉淀2次后离屯、去上清得脱巧后的龟细粉；
[0045] (4)步骤（3)中所得的脱巧龟细粉加入30ml双蒸水，沸煮2个小时，得龟蛋白溶出 液；
[0046] (5)按照5000U的酶量在步骤(4)所得的龟蛋白溶出液中，加入胃蛋白酶酶解龟胶 原蛋白溶液24h，获得龟蛋白多肤。
[0047] 实施例3
[0048] -种制备龟蛋白多肤的方法，包括如下步骤：
[0049] (1)取干燥龟板粉碎成粗粉，经50目筛得龟细粉；
[0050] (2)称取步骤（1)中所得的5g龟细粉，加入40ml的0.3mol/L的抓TA进行混合，振摇 化，加入Imol/L NaOH继续振摇15h，得到反应液；
[0051] (3)在常溫下使用120(K)rpm离屯、步骤(2)所得的反应液，去上清，使用去离子水清 洗沉淀2次后离屯、去上清得脱巧后的龟细粉；
[0052] (4)步骤(3)中所得的脱巧龟细粉加入100mL双蒸水，沸煮3个小时，得龟蛋白溶出 液；
[0053] (5)按照100000U的酶量在步骤(4)所得的龟蛋白溶出液中，加入木瓜蛋白酶酶解 龟胶原蛋白溶液15h，获得龟蛋白多肤。
[0054] 实施例4
[0055] -种制备龟蛋白多肤的方法，包括如下步骤：
[0056] (1)取干燥龟板粉碎成粗粉，经50目筛得龟细粉；
[0057] (2)称取步骤（1)中所得的5g龟细粉，加入30ml的Imol/L的HCL进行混合，振摇化， 加入Imol/L NaOH继续振摇12h，得到反应液；
[005引（3)在常溫下使用120(K)rpm离屯、步骤(2)所得的反应液，去上清，使用去离子水清 洗沉淀2次后离屯、去上清得脱巧后的龟细粉；
[0059] (4)步骤（3)中所得的脱巧龟细粉加入50ml双蒸水，沸煮4个小时，得龟蛋白溶出 液；
[0060] (5)按照30000U的酶量在步骤(4)所得的龟蛋白溶出液中，加入碱性蛋白酶酶解龟 胶原蛋白溶液12h，获得龟蛋白多肤。
[0061] 实施例5
[0062] -种制备龟蛋白多肤的方法，包括如下步骤：
[0063] (1)取干燥龟板粉碎成粗粉，经50目筛得龟细粉；
[0064] (2)称取步骤（1)中所得的5g龟细粉，加入30ml的0.5mol/L的肥L进行混合，振摇 化，加入Imol/L NaOH继续振摇20h，得到反应液；
[0065] (3)在常溫下使用120(K)rpm离屯、步骤(2)所得的反应液，去上清，使用去离子水清 洗沉淀2次后离屯、去上清得脱巧后的龟细粉；
[0066] (4)步骤（3)中所得的脱巧龟细粉加入80ml双蒸水，沸煮5个小时，得龟蛋白溶出 液；
[0067] (5)按照25000U的酶量在步骤(4)所得的龟蛋白溶出液中，加入中性蛋白酶酶解龟 胶原蛋白溶液24h，获得龟蛋白多肤。
[006引实施例6
[0069] -种制备龟蛋白多肤的方法，包括如下步骤：
[0070] (1)取干燥龟板粉碎成粗粉，经50目筛得龟细粉；
[0071] (2)称取步骤（1)中所得的5g龟细粉，加入30ml的O.lmol/L的抓TA进行混合，振摇 池，加入Imol/L NaOH继续振摇15h，得到反应液；
[0072] (3)在常溫下使用120(K)rpm离屯、步骤(2)所得的反应液，去上清，使用去离子水清 洗沉淀2次后离屯、去上清得脱巧后的龟细粉；
[0073] (4)步骤（3)中所得的脱巧龟细粉加入60ml双蒸水，沸煮6个小时，得龟蛋白溶出 液；
[0074] (5)按照15000U的酶量在步骤(4)所得的龟蛋白溶出液中，加入胃蛋白酶酶解龟胶 原蛋白溶液IOh，获得龟蛋白多肤。
[0075] 实施例7不同前处理条件的龟粉蛋白溶出率
[0076] 实验条件如下：
[0077]
[007引实验结果见图I。
[0079] 实施例8不同脱巧剂对龟粉脱巧效率的影响
[0080] 分别用5倍质量的0.25mol/L和0.5mol/L的抓TA溶液、0.5mol/L及1 .Omol/L的盐酸 溶液分别对5g龟细粉(过50目）振摇化，再用50mL的Imol/L的化0田容液浸泡振摇Id后，离屯、， 取上清液，调pH值至3.8,称沉淀质量，确定不同脱巧剂的脱巧效果。结果见图2。
[0081 ]实施例9脱巧剂不同浓度对龟粉脱巧效率的影响
[0082] 称取5g龟细粉（过50目），按照固液比为1: 6加入不同浓度的抓TA溶液（0.125、 0.25、0.5、0.75)，振摇化，再用50血的Imo 1/L的化0田容液浸泡振摇1 d后，离屯、。取上清液，调 pH值至3.8,称沉淀质量，确定不同脱巧剂浓度的脱巧效果。结果见图3.
[0083] 实施例10不同固液比对龟粉脱巧效率的影响
[0084] 称取5g龟细粉(过50目），按照固液比为1: 2、1: 4、1:6、1: 8、1:10加入实施例9所得 的最佳抓TA浓度(0.5M)的溶液，振摇化，再用50血的Imol/L的化0田容液浸泡振摇Id后，离屯、 取上清液，调pH值至3.8,称沉淀质量，确定不同固液比的脱巧效果。结果见图4。
[0085] 实施例11不同脱巧时间对龟粉脱巧效率的影响
[0086] 称取5g龟细粉(过50目），按照1:6固液比加入0.5M抓TA 30mL，振摇6、12、18、24、 4她，再用50mL的Imol/L的化OH溶液浸泡振摇Id后，离屯、取上清液，调pH值至3.8，称沉淀质 量，确定不同脱巧时间的脱巧效果。结果见图5。
[0087] 实施例12不同的沸煮时间对龟蛋白溶出率影响
[0088] 称取5g龟细粉(过50目），按照实施例1-5得到的最优条件进行龟细粉脱巧，离屯、去 上清后，沉淀样品按照1:10固液比加入双蒸水，沸水浴中分别蒸煮1、2、3、4、5、化，测定上清 中总蛋白含量(TCA法），确定最佳的蒸煮时间。结果见图6。
[0089 ]实施例13不同固液比对龟蛋白溶出率影响
[0090] 称取5g龟细粉(过50目），按照实施例1-5得到的最优条件进行龟细粉的脱巧，离屯、 去上清后，沉淀样品按照1: 5、1:10、1:15、1:20固液比加入双蒸水，按照实施例6的结果沸水 浴中蒸煮化，测定上清中总蛋白含量(TCA法），确定最佳的固液比。结果见图7。
[0091] 实施例14不同蛋白酶对龟蛋白溶出液水解度的影响
[0092] 按照实施例7-13实验所得的实验条件获得龟蛋白溶出液，调节蛋白浓度为Img/ mL，在胃蛋白酶、膜蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶各自最适条件下，按照 1000 OU酶量分别加入到含有12mL龟蛋白溶出液的离屯、管中，酶解12h，甲醒滴定法测定水解 度，确定最适酶。结果见图8。
[0093] 实施例15不同中性蛋白酶用量对龟蛋白溶出液水解度的影响
[0094] 按照实施例7-13实验所得的实验条件获得龟蛋白溶出液，调节抑为7,蛋白浓度为 1111邑/111^在48°(：条件下，按照5000、10000、15000、20000、25000、300001]的酶量分别加入到含 有12mL龟蛋白溶出液的离屯、管中，酶解12h，甲醒滴定法测定水解度，确定最佳酶用量。结果 见图9。
[0095] 实施例16不同酶解时间对龟甲蛋白液水解度影响
[0096] 按照实施例7-13实验所得的实验条件获得龟蛋白溶出液，调节抑为7,蛋白浓度为 Img/mL，在48°C条件下，按照20000U的酶用量分别加入到含有12mL龟蛋白溶出液的离屯、管 中，分别酶解1、2、3、4、5、6、9、12、1化，甲醒滴定法测定水解度，确定最佳酶解时间。结果见 图10。
[0097] 实施例17不同底物浓度对龟甲蛋白液水解度影响
[0098] 按照实施例7-13实验所得的实验条件获得龟蛋白溶出液，调节抑为7,取适量龟蛋 白溶出液稀释成0.5、1、2、3mg/血浓度，各取12血，在48°C条件下，按照20000U的酶用量酶解 12h，甲醒滴定法测定水解度，确定最佳酶解的底物浓度。结果见图11。
[0099 ]实施例18不同pH值对龟甲蛋白液水解度影响
[0100] 按照实施例7-13实验所得的实验条件获得龟蛋白溶出液，调节蛋白浓度为Img/ mL，取12mL龟蛋白溶出液，分别调节抑为6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1，在48°(：条件下，按照 20000U的酶用量分别加入到含有12mL龟蛋白溶出液的离屯、管中，酶解12h，甲醒滴定法测定 水解度，确定最佳酶解的pH值。结果见图12。
[0101] 实施例19不同溫度对龟甲蛋白液水解度影响
[0102] 按照实施例7-13实验所得的实验条件获得龟蛋白溶出液，调节抑为6.8,蛋白浓度 为Img/mL，各取12血，在46、47、48、49、50°(：条件下，按照200001]的酶用量酶解1211，甲醒滴定 法测定水解度，确定最佳酶解的溫度条件。结果见图13。
[0103] 实施例20不同酶量、酶解时间、酶解溫度的正交实验结果
[0104] 按照实施例7-13实验所得的实验条件获得龟蛋白溶出液，按照实施例9-13的单因 素条件获得的最佳酶用量(20000U)、酶解时间（1化）、酶解溫度(48°C)条件设置3个因素进 行正交试验，调节P册.8，蛋白浓度Img/mL，各取12mL进行实验，结果见表1。
[0105] 表1不同酶量、酶解时间、酶解溫度的正交实验结果
[0106] 表1不同酶量、酶解时间、酶解溫度的正交实验结果
[0107]
[0108] 实施例21正交试验验证结果
[0109] 按照实施例7-13实验所得的实验条件获得龟蛋白溶出液，按照实施例14获得的正 交试验结果，选用最佳的酶用量(25000U)、酶解时间（1化）、酶解溫度(49°C)进行验证，调节 P册.8，蛋白浓度Img/mL，各取12mL进行实验，结果见表2。
[0110] 表2正交试验验证结果
[0111]
[0112] W上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种龟蛋白多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 取干燥龟板粉碎后过筛得到龟细粉； 按照固液比为1:2~1:10将脱钙剂溶液与所述龟细粉混合并充分反应，接着加入NaOH 溶液，充分反应后得到反应液； 将所述反应液离心后保留沉淀，所述沉淀清洗干净后得到脱钙后的龟细粉； 按照固液比为1:5~1:20将双蒸水与所述脱钙后的龟细粉混合，沸煮lh~6h后得到龟 蛋白溶出液；以及 按照5000U~30000U的酶量向所述龟蛋白溶出液中加入蛋白酶，充分反应后得到龟蛋 白多肽。2. 根据权利要求1所述的制备龟蛋白多肽的方法，其特征在于，所述脱钙剂为HC1或 EDTA。3. 根据权利要求2所述的制备龟蛋白多肽的方法，其特征在于，所述脱钙剂为EDTA，所 述EDTA的浓度为0.1~0.75mol/L。4. 根据权利要求1所述的制备龟蛋白多肽的方法，其特征在于，所述脱钙剂溶液与所述 龟细粉混合后进行振摇，使其充分反应，振摇时间为1~6H。5. 根据权利要求4所述的龟蛋白多肽的制备方法，其特征在于，在所述脱钙剂溶液与所 述龟细粉充分反应后加入NaOH进行振摇，使其充分反应，，所述NaOH的浓度为lmol/L，振摇 时间为6~24H。6. 根据权利要求1所述的龟蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述将反应液离心所使 用的转速是12000rpm。7. 根据权利要求1所述的龟蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述将沉淀清洗干净后 得到脱钙后的龟细粉的方法是使用去离子水清洗沉淀2次。8. 根据权利要求1所述的龟蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述脱钙后的龟细粉按 照固液比1:15加入去离子水，沸煮6个小时。9. 根据权利要求1所述的龟蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶为胰蛋白 酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶中的一种。10. 根据权利要求6所述的龟蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶为中性蛋 白酶，酶量为10000~30000U，酶解时间为6~24h。
【文档编号】C12P21/06GK105861608SQ201610373189
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】单凯, 李玉德, 薛智军
【申请人】深圳凯联龟业有限公司, 深圳前海优百和生物健康研究院有限公司