一种生物转化制备二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(hmzg)的方法
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用微生物转化制备二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)的方法，本发明采用保藏号为Bacillus subtilis ATCC 6633的菌株生物转化得到二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)，经反复硅胶柱层析纯化获得三个单糖苷纯品(HMZG?1、HMZG?2和HMZG?3)。本发明建立了一种高效获得二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷(HMZG)的生物转化方法。
【专利说明】
-种生物转化制备二氨去氨双松柏醇葡萄糖单糖昔(HMZG)的 方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种生物转化制备二氨去氨双松柏醇葡萄糖 单糖巧(HMZG)的方法。
【背景技术】
[0002] 二氨去氨双松柏醇葡萄糖单糖巧(歷ZG)为刺五加、虎杖、接骨木、草珊瑚等药用植 物中的微量活性成分，具有广泛的药理活性，如保肝、抗氧化、抗炎、抗真菌、抗HSV和抗病毒 等。属于苯并二氨巧喃类新木脂素葡萄糖单糖巧。由于其在植物中含量甚微，从植物中提取 分离难W大量制备；利用化学方法糖基化二氨去氨双松柏醇获得其葡萄糖单糖巧步骤复 杂，产率低成本高且可能污染环境，极大地限制了此类化合物的开发利用。
[0003] 微生物转化是利用生物体系中的特异性的酶对外源性底物进行结构修饰所发生 的化学反应。其转化条件溫和、绿色、环保，选择性高，立体专一性强，可W完成化学方法通 常不能进行的反应，而且方法简便。目前生物转化所设及的反应类型有径基化反应、糖基化 反应、幾基化反应、环氧化反应、开环反应和重排反应等。其中，利用生物转化技术进行糖基 化反应获得糖巧化合物已经成为天然小分子糖基化研究的重要手段之一。
[0004] 为了获得高产的二氨去氨双松柏醇葡萄糖单糖巧(歷ZG)，我们开发了一种制备二 氨去氨双松柏醇葡萄糖单糖巧(HMZG)的生物转化制备方法，极大地提高了此类化合物的产 率，使其总产率达到了98.04%，此方法操作简便，生产成本低廉，为开发此类化合物更具潜 力的药用价值奠定了基础。
【发明内容】
[0005] 本发明公开了一种生物转化制备二氨去氨双松柏醇葡萄糖单糖巧化MZG)的方法。 其特征是WBacillus SUbtiliS ATCC 6633菌株发酵转化二氨去氨双松柏醇获得二氨去氨 双松柏醇葡萄糖单糖巧(HMZG)。
[0006] 为了获得高产的二氨去氨双松柏醇葡萄糖单糖巧化MZG)，本发明筛选了 PDA培养 基、BPY培养基、NA培养基和LB培养基等多种培养基作为发酵转化培养基用于生物转化，发 现Bacillus SUbtiliS ATCC 6633菌株在多种培养条件下均可转化二氨去氨双松柏醇得到 3个二氨去氨双松柏醇葡萄糖单糖巧化MZG-I、歷ZG-2和歷ZG-3 )，在PDA培养基中总转化率 最高(见表1)。
[0007] 表1不同培养基中二氨去氨双松柏醇葡萄糖单糖巧的转化率
[000引
[0009] WPDA培养基为基础培养基，筛选不同碳源(葡萄糖、薦糖、麦芽糖、乳糖、淀粉）、碳 源含量及转化发酵条件对生物转化发酵的影响。优选培养基碳源为薦糖，含量为每升培养 基中含25g薦糖。转化发酵培养溫度为20-30°C，优选26°C。生物转化发酵培养时间为24-96h，优选培养时间为72h。
[0010] 本发明公开了二氨去氨双松柏醇葡萄糖单糖巧化MZG)的制备方法，用Bacillus SUbtiIis ATCC 6633对二氨去氨双松柏醇进行生物转化获得。
[0011] 更优选的方法是W二氨去氨双松柏醇为底物，利用保藏号为BaciIlus SUbtiliS ATCC 6633的菌株，将底物和该菌株在W上优选的培养基中进行转化发酵72h，终止反应，用 有机溶剂萃取，浓缩萃取液，通过反复硅胶柱层析分离即得二氨去氨双松柏醇葡萄糖单糖 巧(HMZG)O
[0012] 其中有机溶剂优选乙酸乙醋，硅胶柱层析用二氯甲烧和甲醇进行梯度洗脱。所得 转化产物为浅黄色粉末状固体。
[0013] 其中浅黄色粉末状转化产物分别为二氨去氨双松柏醇-4-O-0-D-化喃葡萄糖巧 化MZG-I )、二氨去氨双松柏醇-g/-O-P-D-化喃葡萄糖巧(HMZG-2)和二氨去氨双松柏醇-9-O-P-D-化喃葡萄糖巧(HMZG-3)。
[0014] 本发明的制备方法与现有技术相比：
[0015] (1)通过生物转化的方法制备天然来源极其有限的活性成分，转化发酵制备产率 高，二氨去氨双松柏醇葡萄糖单糖巧(HMZG)产率达到98.04%。
[0016] (2)转化制备获得^个糖巧丽26-1、丽26-2和删26-3，转化率分别为17.34%、 14.29%、66.41 %。歷ZG-3产率最高，为此化合物的获得和药用价值的进一步探讨奠定了基 础。
[0017] (3)操作简便，成本低，绿色环保，适合大量制备此类化合物。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过实施例进一步说明本发明。应当理解的是，本发明实施例的制备方法仅 用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的生物转化制备二氨去氨双松柏醇糖 巧(歷ZG)的构思前提下，类似的制备方法都属于本发明要求保护的范围。转化产物的核磁 共振氨谱和碳谱用化址er 500测定，高分辨质谱用Aglient LC-Q-TOF-MS 6520B测定;色谱 柱为C18分析色谱柱(0DS-2,5wIl，4.6X250mm，汉邦科技），所用溶剂均为分析纯或化学纯。 [00 19] 实施例1
[0020] HMZG-I、HMZG-2 和 HMZG-3 的制备（Wpda 培养基培养）
[0021] 将斜面（即菌种)接种于摇瓶种子培养基中，在26°C培养24小时，摇瓶转速为18化/ min;按2 %接种量接入PDA转化培养基（马铃馨200g/L，K出P〇4 3g/L，MgS〇4 O . 73g/L，VBi lOmg/L，薦糖25g/L，抑7.0)中，同时加入0.2mg/mL的底物，在26°C，转速为180r/min条件下 发酵培养72hDHPLC检测其S个转化产物丽ZG-1、丽ZG-2和丽ZG-3的转化率，检测条件为乙 腊-水梯度洗脱，洗脱程序为：O-IOmin 15 % -24%乙腊，10-25min 24 % -30 %乙腊，25-30min 30 % 乙腊;流速 1. OmL/min;柱溫25 °C ;检测波长20：3nm;进样量IOiiLeHMZG-I、HMZG-2 和 HMZG-3 的保留时间分别为 12.306111111、14.817111111和15.359111111，转化率分别为17.34%、 14.29%、66.41%。
[0022] 实施例2
[0023] HMZG-I、HMZG-2 和 HMZG-3 的制备（WBPY 培养基培养）
[0024] 将斜面（即菌种)接种于摇瓶种子培养基中，在26°C培养24小时，摇瓶转速为18化/ min;按2%接种量接入8口￥转化培养基（牛肉浸膏5.0邑凡、蛋白腺10.0邑几、酵母膏5.0邑/1、 NaCl 5. Og/L、葡萄糖10.Og/L，抑7.0)中，同时加入0.2mg/mL的底物，在26°C，转速为ISOr/ min条件下发酵培养72hDHPLC检测其S个转化产物HMZG-1、歷ZG-2和歷ZG-3的转化率，检测 条件同实施例1，转化率分别为13.20 %、10.36 %、50.24 %。
[0025] 实施例3
[0026] HMZG-I、HMZG-2 和 HMZG-3 的制备（WNA 培养基培养）
[0027] 将斜面（即菌种)接种于摇瓶种子培养基中，在26°C培养24小时，摇瓶转速为18化/ min;按2%接种量接入NA转化培养基(牛肉浸膏3.Og/L、蛋白腺10.0g/L、NaCl 5.Og/L、琼脂 18. Og/L，pH 7.0)中，同时加入0.2mg/mL的底物，在26°C，转速为180r/min条件下发酵培养 72hDHPLC检测其S个转化产物HMZG-UHMZG-2和HMZG-3的转化率，检测条件同实施例1，转 化率分别为 10.50%、13.51 %、45.98%。
[0028] 实施例4
[0029] HMZG-I、HMZG-2 和 HMZG-3 的制备（WLB 培养基培养）
[0030] 将斜面（即菌种)接种于摇瓶种子培养基中，在26°C培养24小时，摇瓶转速为18化/ min;按2 %接种量接入LB转化培养基(酵母浸膏5. Og/L、膜蛋白腺10.0 g/L、化Cl 10.0 g/L， pH 7.0)中，同时加入0.2mg/mL的底物，在26°C，转速为18化/min条件下发酵培养72h dHPLC 检测其S个转化产物歷ZG-I、丽ZG-2和丽ZG-3的转化率，检测条件同实施例1，转化率分别 为 8.91%、14.11%、60.56%。
[0031] 实施例5
[0032] HMZG-I、HMZG-2 和 HMZG-3 的分离纯化
[0033] 按照实施例1的方法，发酵液乙酸乙醋萃取后，减压浓缩得浸膏。将所得浸膏通过 硅胶柱色谱(200-300目）梯度洗脱，流动相比例为100%二氯甲烧、二氯甲烧：甲醇(9:1)、二 氯甲烧：甲醇(6:1)和100 %甲醇，合并所得馈分，得到S个糖巧转化产物丽ZG-I、丽ZG-2和 HMZG-3。
[0034] 实施例6
[0035] HMZG-I、HMZG-2 和 HMZG-3 的结构表征
[0036] HMZG-1:淡黄色粉末，C26 曲 4〇ii，ESI-MS m/z:545.2004[M+Na] + .iH NMR(CD30D， 500MHz)S:7.14(lH，d J = 8.甜z，H-5)，7.03(lH，s，H-2)，6.93(lH，dd，J = 2.0,8.5Hz，H-6)， 6.73(lH，s，H-6' ),6.72(IH，S，H-2' ),5.55(lH，d，J = 6.OHz，H-7) ,4.88(lH，d，J = 7.甜Z，H- Glc-l)，3.86(3H，s，3'-0CH3)，3.85(lH，over lap，H-9a)，3.83(3H，s，3-0CH3)，3.75(lH，dd， J = 7.5，11.0Hz，H-9b)，3.38-3.70(5H，overlap，Glc)，3.56(2H，t，J = 6.甜z，H-9')，3.48 (IH'over lap，H-8)，2.62(2H，t，J = 8.0Hz，H-7' )，1.81(2H，m，H-8' ).i3c 醒R(CD30D， 125MHz)S:151.0(C-3)，147.6(C-4)，147.5(C-4')，145.3(C-3')，138.4(C-l)，137.1(C-1' )，129.6(05' )，119.4(06)，118.2(C-5)，118.0(02' ),114.3(C-6' )，111.3(02)， 102.9(C-l")，88.5(C-7)，78.2(C-3")，77.9(C-5")，74.9(C-2")，71.4(C-4")，65.1(C-9)， 62.5(C-6" )，62.2(C-9' )，56.8(C-3-0CH3)，56.7(C-3'-0CH3)，55.7(C-8)，35.8(C-8' ),32.9 (C-7').
[0037] HMZG-2:淡黄色粉末，C26 曲 4〇ii，ESI-MS m/z:545.2006[M+化 r.iH NMR(CD30D， 500MHz). S :6.95( IH，S，H-2) ,6.82( lH，d，J = 7. OHz，H-6) ,6.77( lH，d，J = 8.甜 Z，H-5) ,6.74 (2H，S，肥'-and 6' ),5.49(lH，d，J = 6.OHz，H-7) ,4.25(lH，d，J = 7.甜Z,GlcH-I),3.91 (IH， m，H-9')，3.85and 3.81(each 3H，s，2-0Me)，3.82(lH，m，H-9)，3.76(lH，dd，J=10.5and 7.0Hz，H-9)，3.66(lH，dd，J=11.0and4.甜z，H-6")，3.54aH，m，H-9')，3.46aH，m，H-8)， 3.35()，3.33()，3.27(),3.19(lH，m，H-2")，2.67(2H，br.t， J = 7.0Hz，H-7' )，1.90(2H，m，H-8' )。130 NMR(CD30D，125MHz):S:149.1(C-3)，147.6(C-4')， 147.5(C-4)，145.2(C-3')，136.9(C-5')，134.8(C-1)，129.9(C-1')，119.7(C-6)，118.1(C-6' )，116.2(05)，114.3(02' )，110.6(02)，104.5(C-1")，89.0(C-7)，78.2(C-3" ),77.9 (C-5")，75.2(C-2")，71.7(C-4")，70.0(C-9')，65.0(C-9)，62.8(C-6")，56.8(C-3-0CH3)， 56.4(C-3' -0CH3),55.4(C-8),32.9(C-80,32.9(C-70.
[003引 HMZG-3:淡黄色粉末，C26 曲 40ii，ESI-MS m/z:545.2004[M+化]+ .IH 醒 R(CD30D， 500MHz).S:7.0〇aH，s，H-2)，6.86(lH，d，J=13.0Hz，H-6)，6.79aH，d J=13.0Hz，H-5)， 6.75(lH，s，H-6' )，6.73( IH，S，H-2' ),5.59( lH，t，J = 6.5Hz，H-7) ,4.35( lH，d，J = 7. OHz， glc H-l")，4.11(lH，dd，J=9.5,5.5Hz，H-9a)，3.85(3H，s，3-0Me)，3.82(3H，s，3'-0 Me)， 3.76(lH，dd，J = 9.5,7.0Hz，H-9b)，3.67(lH，m，H-6")，3.64(lH，m，H-8)，3.57(2H，t，J = 6.0Hz，H-9' )，3.36(lH，m，H-3")，3.35aH，m，H-4")，3.27(lH，m，H-5")，3.23(lH，t，J = 8.甜z，H-2")，2.63(2H，t，J = 7.0Hz，H-7')，1.82(2H，m，H-8').UCNMR(CD30D，125MHz):S; 149.0(C-3)，147.5(C-4)，147.5(C-4')，145.2(C-3')，136.9(C-1)，134.8(C-5')，129.7(C-1' )，119.7(06)，118.2(C-6' ),116.1(C-5)，114.2(C-2' ),110.7(C-2)，104.6(C-1" ),89.0 (C-7)，78.3(C-3")，78.1(C-5")，75.2(C-2")，72.5(C-9)，71.6(C-4")，62.9(C-6"),62.3 (C-9' )，56.8(3-0Me),56.4(3'-0Me)，53.3(C-8)，35.8(C-8' )，32.9(C-7').
【主权项】
1. 一种生物转化制备二氢去氢双松柏醇糖苷的方法，其特征是以保藏菌种号为 Bacillus subtilis ATCC 6633菌株培养转化二氢去氢双松柏醇获得二氢去氢双松柏醇葡 萄糖单糖苷。2. 按照权利要求1所述的生物转化方法，其特征是以Bacillus subtilis ATCC 6633为 微生物转化菌株。3. 按照权利要求1所述的生物转化方法，其特征是以二氢去氢双松柏醇为微生物转化 底物，转化产物为二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷。4. 按照权利要求1所述的生物转化方法，其特征是二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷为 二氢去氢双松柏醇-4-〇-i3_D-吡喃葡萄糖苷，二氢去氢双松柏醇-Ο-β-D-吡喃葡萄糖苷 和二氢去氢双松柏醇-9-〇-i3_D-吡喃葡萄糖苷。5. 按照权利要求1所述的生物转化方法，其特征为Bacillus subtilis ATCC 6633菌株 转化发酵培养温度为20-36 °C，底物加入时间为0_72h，加入底物后生物转化发酵2-5天。6. 按照权利要求5所述的方法，其特征在于培养基碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、 ?疋粉中的一种或几种，碳源含为l〇_30g/L。7. 按照权利要求6所述，优选碳源含量为每升培养基中含25g蔗糖，优选转化发酵温度 26°C。转化产物为二氢去氢双松柏醇葡萄糖单糖苷。
【文档编号】C12R1/125GK105861601SQ201610294183
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】刘吉华, 余伯阳, 盖晓红
【申请人】中国药科大学