肽-树脂结合物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及适用于肽的合成的肽-树脂结合物。更具体而言，本发明涉及序列中 含有二氨基酸的短肽，以及其在肽酰胺的合成中的应用。
【背景技术】
[0002] 将对酸不稳定的三苯甲基型树脂用于肽和受保护肽的固相合成在本领域中是已 知的（例如，参见 Barlos K，Chatzi 0, Gatos D，Stavropoulos G·，Int J Pept Protein Res. 1991Jun ;37 (6) :513-20)。肽树脂结合物通常通过以羧基为端基的共辄酯键而与树脂 相连（例如，参见US 7, 939, 629)。还已知肽-树脂结合物通过末端赖氨酸氨基酸残基的侧 链而与树脂相连（例如，参见US2009/0292106)。
[0003] 通常使用的Rinck-酰胺树脂可得到肽酰胺，在许多情况中其包含若干副产物，这 些副产物来源于连接物的部分裂解。
[0004] Giraud等人在US2010/0197891中描述了这样一种方法：其中，在化学合成中，借 助氨基酸侧链中的氨基将生长肽链固定至固相支持体上。然而，US2010/0197891并未披露 肽酰胺与树脂连接。
[0005] 本发明旨在提供用于肽合成中的新型肽-树脂结合物。更具体而言，在一个实施 方案中，本发明旨在提供新型肽-树脂结合物以及与之相关的方法，该方法能够制备表现 出如下一种或多种特征的肽，这些特征为：更高的产率、更高的纯度、更少的副反应以及更 温和的反应条件。
[0006] 在随附的权利要求中描述了本发明的各方面，在下文中将对本发明的各方面进行 更为详细地说明。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一方面涉及具有式（2'）的肽-树脂结合物，
[0009] 其中：
[0010] Pr1选自H、烷基、芳基、芳烷基、酰基、芳酰基和保护基团；
[0011] Y为包含两个或更多个天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基的天然肽或合成肽， 其中所述天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基均可任选地被保护，并且其中所述天然肽或 合成肽选自：
[0012] [1] 3-疏基丙酰基-D-Tyr (Et)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-;
[0013] [2]Arg-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-；
[0014] [3]Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-；
[0015] [4]Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-；
[0016] [5] 3_ 疏基丙酰基-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-;
[0017] [6]Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-；
[0018] [7]Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-2-Nal-Leu-；
[0019] [8]Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (tBu)-Leu-；
[0020] [9]Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu) -Leu-；
[0021] [10]Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-；
[0022] [11]Pyr-His ~Trp-Ser-Tyr-D-His(Bzl)-Leu-;
[0023] [12]Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-；
[0024] [13]D-2-Nal-4-氯-D-Phe-β -(3-吡啶基）-D-Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-;
[0025] [14]D-2-Nal-D-4-Cpa-D-3-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Hci-Nle-；
[0026] [15] Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-T hr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-；
[0027] [16]Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-；
[0028] [17]Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-L eu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IIe-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gl n-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-；
[0029] [18]Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-L eu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-IIe-Met-Ser-；
[0030] [19]Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-；
[0031] [20]Tyr-Pro-Ser-Lys-Pr〇-Asp-Asn-Pr〇-Gly-Glu-Asp-Ala-Pr〇-Ala-Glu-Asp-M et-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-;和
[0032] [21]Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-L eu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-；
[0033] Dia为天然二氨基酸或非天然二氨基酸；
[0034] A为与二氨基酸的侧链氨基官能团结合的聚合物树脂；
[0035] X为可任选被保护的天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基；或者为包含2至15个 天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基的天然肽或合成肽，这些氨基酸残基均可任选地被保 护；
[0036] 札和R 2各自独立地选自H、烷基、芳基、芳烷基、NHjPNH-CO-NH 2。
[0037] 据我们所知，至今还没有公开过本发明所披露的肽-树脂结合物。也没有公开过 本发明所披露的肽-树脂结合物在肽合成中的应用。
[0038] 有利的是，本发明的肽酰胺结合物能够以更高的产率和/或更高的纯度和/或更 少的副反应来制备肽。此外，将肽酰胺从树脂上除去所需的温和的反应条件使得能够获得 受到保护或部分保护的形式的肽酰胺，即，该方法使得能够使部分保护的肽酰胺与树脂裂 解。这使得能够选择性地将所获得的肽转化为相应的胍基化（guanylated)肽。本发明的 结合物尤其可用于本文所述的多种特定肽的制备。
[0039] 本发明的第二方面涉及肽-树脂结合物，其选自如下这些结合物：
[0041] 其中所述树脂为选自三苯甲基树脂、2-氯-三苯甲基树脂、4-甲基-三苯甲基树 月旨、和4-甲氧基-三苯甲基树脂中的可TFA裂解的聚合物树脂；并且
[0042] Pr1选自H、烷基、芳基、芳烷基、酰基、芳酰基和保护基团。
[0043] 本发明的第三方面涉及制备式（2)的肽-树脂结合物的方法，
[0045] 其中：
[0046] Pr1选自H、烷基、芳基、芳烷基、酰基、芳酰基和保护基团；
[0047] Y为直接结合键（direct bond);或者为可任选被保护的天然氨基酸残基或非天 然氨基酸残基；或者为包含2至200个天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基的天然肽或合 成肽，其中这些氨基酸残基均可任选地被保护；
[0048] Dia为天然二氨基酸或非天然二氨基酸；
[0049] A为与所述二氨基酸的侧链氨基官能团结合的聚合物树脂；
[0050] X为可任选被保护的天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基；或者为包含2至15个 天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基的肽，这些氨基酸残基均可任选地被保护；
[0051] 札和R 2各自独立地选自H、烷基、芳基、芳烷基、NHjPNH-CO-NH2;
[0052] 所述方法包括在碱存在的条件下，于合适的溶剂中使式（1)的肽酰胺与合适的树 脂卤化物反应的步骤，
[0053] Pr1-Y-Dia-X-NR1R2
[0054] 式（1)
[0055] 其中PrpDiaJJUP R2的定义如上所述。
[0056] 本发明的第四方面涉及由式（2)的肽-树脂结合物制备含有精氨酸的肽或者所述 肽的盐的方法，
[0058] 其中：
[0059] Pr1选自H、烷基、芳基、芳烷基、酰基、芳酰基和保护基团；
[0060] Y为直接结合键；或者为可任选被保护的天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基； 或者为包含2至200个天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基的天然肽或合成肽，其中这些 氨基酸残基均可任选地被保护；
[0061] Dia为鸟氨酸；
[0062] A为与二氨基酸的侧链氨基官能团结合的聚合物树脂；
[0063] X为可任选被保护的天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基；或者为包含2至15个 天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基的天然肽或合成肽，这些氨基酸残基均可任选地被保 护；
[0064] 札和R 2各自独立地选自H、烷基、芳基、芳烷基、NH 2和NH-CO-NH2;
[0065] 所述方法包括如下步骤：
[0066] (a)将所述式⑵的肽-树脂结合物中的N端α -氨基官能团脱保护，以除去保护 基团Pr1;
[0067] (b)使具有游离或活化的羧酸官能团的、至少N端被保护的氨基酸或肽与步骤（a) 中的脱保护的α-氨基官能团偶联，从而使式（2)的化合物延长，
[0068] (c)可任选地将步骤（a)和（b)重复一次或多次，其中至少N端被保护的氨基酸或 肽与前一步骤（b)中的至少N端被保护的氨基酸或肽相同或不同；
[0069] (d)使所得到的肽与A裂解；
[0070] (e)将步骤（d)中获得的肽的鸟氨酸残基（Dia)的侧链进行胍基化；
[0071] (f)可任选地将步骤（d)之后剩余的所有保护基团除去；
[0072] (g)分离所获得的肽并可任选地将其纯化。
[0073] 本发明的第五方面涉及由式（2b)、（2c)、（2d)、（2e)或（2f)的肽-树脂结合物制 备肽或者肽的盐的方法，
[0076] 其中所述树脂为选自三苯甲基树脂、2-氯-三苯甲基树脂、4-甲基-三苯甲基树 月旨、和4-甲氧基-三苯甲基树脂中的可TFA裂解的聚合物树脂；并且
[0077] Pr1选自H、烷基、芳基、芳烷基、酰基、芳酰基和保护基团；
[0078] 所述方法包括如下步骤：
[0079] (a)将所述式（2b)、（2c)、（2d)、（2e)或（2f)的肽-树脂结合物中的N端α -氨 基官能团脱保护，以除去保护基团Pr1;
[0080] (b)使具有游离或活化的羧酸官能团的、至少N端被保护的氨基酸或肽与步骤（a) 中的脱保护的Ct-氨基官能团偶联，从而使式（2b)、（2c)、（2d)、（2e)或（2f)的化合物延 长，
[0081] (C)可任选地将步骤（a)和（b)重复一次或多次，其中至少N端被保护的氨基酸或 肽与前一步骤（b)中的至少N端被保护的氨基酸或肽相同或不同；
[0082] (d)使所得到的肽与树脂裂解；
[0083] (e)可任选地对步骤（d)中获得的肽进行胍基化；
[0084] (f)可任选地将步骤⑷之后剩余的所有保护基团除去；
[0085] (g)分离所获得的肽并可任选地将其纯化。
[0086] 本发明的第六方面涉及上述结合物在肽的制备中的应用，其中所述肽选自：
[0087] [1] 3_ 疏基丙酰基-D-Tyr (Et)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2;
[0088] [2] Arg8-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 ；
[0089] [3] H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-CyS-Pro-Orn-Gly-NH2;
[0090] [4]H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-LyS-Gly-NH 2;
[0091] [5] 3_ 疏基丙酰基-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2;
[0092] [6]Pyr-HiS-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2;
[0093] [7]Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-2-Nal-Leu-Arg-Pr〇-Gly-NH 2；
[0094] [8]Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH 2;
[0095] [9]Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt ；
[0096] [10]Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt ；
[0097] [IIjPyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(Bzl)-Leu-Arg-Pro-NHEt ；
[0098] [12]Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt ；
[0099] [13] Ac-D-2-Nal-4-氯-D-Phe- β - (3-吡啶基）-D-Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2;
[0100] [14]Ac-D-2-Nal-D-4-Cpa-D-3-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Hci-Nle-Arg-Pr〇-D-Ala-NH 2;
[0101] [15]H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys -Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2;
[0102] [16]Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH 2;
[0103] [I7]H-Tyr-Ala-Asp-Ala-IIe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH 2;
[0104] [18]H-Tyr-Ala-Asp-Ala-IIe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln -Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2;
[0105] [19]Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH 2;
[0106] [20]H-Tyr-Pr〇-Ser-Lys-Pr〇-Asp-Asn-Pr〇-Gly-Glu-Asp-Ala-Pr〇-Ala-Glu-Asp -Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH 2^
[0107] [2I]H-Tyr-Pro-IIe-Lys-Pr〇-Glu-Ala-Pr〇-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pr〇-Glu-Glu -Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg- Tyr-NH2;S其药学可接受的盐。
[0108] 本发明的第七方面涉及通过或可通过本文所述方法获得的肽。
[0109] 发明详述
[0110] 本文所用的术语"烷基"包括可被取代（单取代或多取代）或未被取代的饱和直 链或支链烷基。优选的是，烷基为C 1 2。烷基，更优选为C i 15烷基，还更优选为C i 12烷基，还 更优选为C16烷基，更优选为C13烷基。尤其优选的烷基包括（例如）甲基、乙基、丙基、异 丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。适合的取代基包括（例如）选自〇H、0-烷基、卤 素、NH 2、NH-烷基、N-(烷基）2、CF3、N02、CN、COO-烷基、C00H、C0NH 2、CO-NH-烷基、CO-N(烷 基）2、SO2-烷基、SO 2NHjP SO 2NH-烷基中的一种或多种基团。
[0111] 本文所用的术语"芳基"指的是可被取代（单取代或多取代）或未被取代的C6 12芳 香族基团。其典型的例子包括苯基和萘基等。适合的取代基包括（例如）选自0H、0-烷基、 卤素、NH 2、NH-烷基、N-(烷基）2、CF3、N02、CN、C00-烷基、C00H、CONH 2XO-NH-烷基、CO-N(烷 基）2、SO2-烷基、SO 2NHjP SO 2-NH-烷基中的一种或多种基团。
[0112] 所用的术语"芳烷基"为上述术语烷基和芳基的联合。本文所用的术语"芳酰基" 指的是"Ar-CO"基团，其中Ar为上文中所定义的芳基。芳酰基的例子包括苯甲酰基和萘甲 酰基。
[0113] 本文所用的术语"酰基"是指"烷基-C0"基团，其中烷基的定义见上文。
[0114] 本发明化合物的药学可接受的盐包括其适当的酸加成盐和碱盐。Berge等人的J Pharm Sci，66, 1-19(1977)中有关于适当的药物盐的综述。例如，可利用下述酸来形成盐， 所述酸为：强无机酸，例如矿物酸，如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机羧酸，如具有1至4个取 代（例如，被卤素取代）或未取代的碳原子的烷烃羧酸，如乙酸；饱和或非饱和二羧酸，例 如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或对苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血 酸、羟基乙酸、乳酸、羟基丁二酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲 酸；或者有机磺酸，如取代（例如，被卤素取代）或未取代的（C 1-C4)-烷基磺酸或芳基磺酸， 如甲烷磺酸或对甲苯磺酸。乙酸盐是尤其优选的。
[0115] 在本发明的前述所有方面中，本发明适当地包括本发明化合物的所有对映异构体 和互变异构体。本领域的技术人员将会得知具有光学性质（具有一个或多个手性碳原子） 或互变异构特性的化合物。可通过本领域已知的方法来分离/制备相应的对映异构体和/ 或互变异构体。
[0116] 本发明的一些化合物可以立体异构体和/或几何异构体存在，例如，其可具有一 个或多个非对称中心和/或几何中心，从而可以两种或多种立体异构和/或几何异构的形 式存在。本发明预期可使用这些化合物的各立体异构体和几何异构体、及其混合物。权利 要求中所用的术语包括所有这些形式。
[0117] 本发明还包括这些化合物或其药学可接受的盐的所有合适的同位素变体。本发明 的药剂或其药学可接受的盐的同位素变体的定义为：其中至少一个原子被具有相同原子数 但原子量不同于自然界中所通