本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及一种辛卡利特的纯化方法。
背景技术：
中文名：辛卡利特
英文名：Sincalide Acetate
结构式：Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2
分子式：C49H62N10O16S3
分子量：1143.27
辛卡利特（Sincalide）是一种人工合成的胆囊素八肽(Octapeptide)，主要用于促胆囊收缩，胆囊诊断试剂，临床用于治疗慢性胰腺炎，发现胰分泌功能明显改善，症状明显减轻。徐满英（哈尔滨医科大学生理教研室，哈尔滨，150086）通过大鼠实验得出，辛卡利特的抗电针镇痛作用在中枢痛反应神经元电活动和整体行为反射水平上是协调一致的，表明辛卡利特能有效提高临床针刺的镇痛疗效。
目前国内外关于辛卡利特的合成报道不多，CN201410105423.X中采用盐浴的方法切割来防止磺酰基团的脱落，最终辛卡利特纯品的收率为42%，并且切割方法复杂，辛卡利特的合成制备周期长，不利于规模化生产。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种纯度高、收率高的辛卡利特的纯化方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种辛卡利特的纯化方法，该方法包括以下顺序的制备纯化步骤：
（1）、将溶胀、脱保护并洗涤后的氨基树脂与活化的保护氨基酸溶液于30℃的恒温震荡器中反应40-90min，依次接入从树脂端起第1-8个氨基酸相对应的保护氨基酸，得到Fmoc-辛卡利特前体肽Ⅰ-氨基树脂：
Fmoc-Asp(otBu)-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp(Boc)-Met-Asp(otBu)-Phe-氨基树脂：
（2）、将上述制得的辛卡利特前体肽Ⅰ-氨基树脂脱保护并洗涤后抽干至颗粒状，加入切割试剂，进行切割反应、沉降后，得到辛卡利特粗肽Ⅱ：
（3）、将辛卡利特粗肽Ⅱ溶于溶剂中，经反相高效液相色谱法纯化、冻干，得到辛卡利特纯品多肽。
步骤（1）中所述的氨基树脂为Rink Amide-MBHA Resin，其取代度为0.35～0.5mmol/g；所述的溶胀是指将氨基树脂浸没在DCM溶剂中2h。
步骤（1）中活化的保护氨基酸溶液制备方法为：将保护氨基酸和HOBT加入到离心管中，加入DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC，混合使其完全溶解得到活化的保护氨基酸溶液。
步骤（1）中所述的保护氨基酸为：Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Tyr(SO3H)-OH.Na、Fmoc-Asp(otBu)-OH。
步骤（1）和步骤（2）中所述的脱保护并洗涤是指：将溶液抽干后，加入1/3-1/2反应器体积的20%哌啶/DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空泵将溶液抽干；再加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇1min，用真空泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤树脂，重复操作3次。
步骤（2）中所述的切割试剂100ml配置为：94ml TFA+2.5ml TIS+2.5ml H2O+1ml EDT；切割反应条件为：置于20r/min的脱色摇床上，于-20℃条件下冰浴切割反应20min；所述的沉降选用-20℃低温预冷的无水乙醚，离心沉降3次。
步骤（3）所述的溶剂为15%乙腈和水的混合溶液。
步骤（3）所述的纯化选用C4填料制备柱进行反相高效液相色谱纯化，以A相：0.2%乙酸/水，B相：0.2%乙酸/乙腈为流动相，以B.Cone/%（2→70），0→70min的梯度程序，9ml/min的流速进行多肽的分离提纯。
本发明的有益效果：本发明采用冰浴切割的方法进行多肽-树脂的切割，同样避免了磺酰基团的脱落，并采用优化的纯化工艺进行辛卡利特粗肽的纯化，产品纯度达到99%，产品收率达到60%以上，大大缩短了生产周期，降低了生产成本，产品收率大幅度提高，有利于工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。
本发明固相合成制备辛卡利特，以氨基树脂为起始树脂载体，氨基树脂为Rink Amide-MBHA Resin，其取代度为0.35～0.5mmol/g；通过固相合成法依次缩合辛卡利特氨基酸序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸，经活化剂和缩合剂缩合反应及脱保护剂的脱保护反应，得到辛卡利特前体肽Ⅰ-氨基树脂，之后脱掉天冬氨酸的Fmoc保护基，洗涤树脂并进行切割、沉降后，得到辛卡利特粗肽Ⅱ，粗肽经过纯化及冻干后得到辛卡利特纯品多肽。
固相合成法依次缩合的Fmoc-保护氨基酸为：Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Tyr(SO3H)-OH.Na、Fmoc-Asp(otBu)-OH，缩合反应中氨基酸投料量为所投氨基树脂摩尔数的2-4倍，缩合反应温度为20-40℃。缩合反应所使用的活化剂和缩合剂分别为DIC、HOBT，缩合反应时间为40-90min；脱保护剂为20%哌啶/DMF的混合溶液，洗脱时间为15-30min。
实施例1
氨基树脂的溶胀：称量取代度为0.38mmol/g的Rink-MBHA-Resin 0.1g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀2h。
1、Fmoc-辛卡利特树脂的合成
Fmoc-辛卡利特前体肽Ⅰ-氨基树脂为：
Fmoc-Asp(otBu)-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp(Boc)-Met-Asp(otBu)-Phe-氨基树脂
本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1-8个氨基酸相对应的保护氨基酸及分子量如下表1所示：
表1
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
保护氨基酸的活化方法
以Fmoc-Phe-氨基树脂的缩合为例，按照计算的理论投料量称取24mgFmoc-Phe-OH和13mg HOBT于离心管中，加2ml DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加10ul DIC，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。
树脂的脱保护以及洗涤方法
将氨基树脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反应器体积的20%哌啶与DMF混合溶液，置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空泵将脱保护溶液抽干；再加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇1min，用真空泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤树脂，重复操作3次。
茚三酮显色检测合格后，将上述的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于30℃的恒温震荡器中反应40-90min。采用上述同样方法，依次接入第2-8个氨基酸对应的Fmoc-保护氨基酸，即得到Fmoc-辛卡利特前体肽Ⅰ-氨基树脂。
2、辛卡利特粗肽Ⅱ的合成
将Fmoc-辛卡利特前体肽Ⅰ-氨基树脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反应器体积的20%哌啶与DMF混合溶液，置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空泵将溶液抽干；再加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇1min，用真空泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤Fmoc-辛卡利特前体肽Ⅰ-氨基树脂，重复操作3次。
将反应器中的树脂用真空泵抽干至颗粒状，配置10ml切割试剂：9.4ml TFA+0.25ml TIS+0.25ml H2O+0.1ml EDT，加入到反应器中，反应器置于20r/min的脱色摇床上，于-20℃冰浴条件下切割反应20min。多肽的沉降选用-20℃低温预冷的无水乙醚，离心沉降3次，得到乳胶状的粗肽样品。
将粗品冻干后称重，得到粉末状样品36mg，根据粗品的量和合成测定实际取代度（SD=0.3mmol/g）计算的理论量，计算粗品收率达到90.3%，比现有技术仅40-60%的收率有大幅度成倍的提高。
3、辛卡利特纯品多肽的纯化
用15%乙腈和水的混合溶液溶解辛卡利特粗品Ⅱ，经反相高效液相色谱法纯化得到辛卡利特多肽，纯化条件为：C4填料制备柱，流动相为A相：0.2%乙酸/水，B相：0.2%乙酸/乙腈，流速9ml/min，检测波长210nm，制备梯度程序
收集样品峰溶液，冻干后称重得样品为23.1mg，经分析计算，辛卡利特产品纯度达到99%，其纯品收率达到61.3%。本发明中通过降低流动性PH值以提高离子配对能力，有利于纯化并提高纯度，并且优化了纯化梯度，缩短了纯化时间，节省了纯化流动相的使用，降低了生产成本。
实施例2
氨基树脂的溶胀：称量取代度为0.45mmol/g的Rink-MBHA-Resin 2g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，浸泡过夜。
1、Fmoc-辛卡利特树脂的合成
Fmoc-辛卡利特前体肽Ⅰ-氨基树脂为：
Fmoc-Asp(otBu)-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp(Boc)-Met-Asp(otBu)-Phe-氨基树脂
保护氨基酸的活化方法
以Fmoc-Phe-氨基树脂的缩合为例，按照计算的理论投料量称取510mgFmoc-Phe-OH和260mgHOBT于离心管中，加12ml DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加200ul DIC，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。
树脂的脱保护以及洗涤方法
将氨基树脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反应器体积的20%哌啶与DMF混合溶液，置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空泵将脱保护溶液抽干；再加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇90s，用真空泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤树脂，重复操作3次。
茚三酮显色检测合格后，将上述的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于30℃的恒温震荡器中反应40-90min。采用上述同样方法，依次接入表1中第2-8个氨基酸对应的Fmoc-保护氨基酸，即得到Fmoc-辛卡利特前体肽Ⅰ-氨基树脂。
2、辛卡利特粗肽Ⅱ的合成
将Fmoc-辛卡利特前体肽Ⅰ-氨基树脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反应器体积的20%哌啶与DMF混合溶液，置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空泵将溶液抽干；再加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇90s，用真空泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤Fmoc-辛卡利特前体肽Ⅰ-氨基树脂，重复操作3次。
将反应器中的树脂用真空泵抽干至颗粒状，配置100ml切割试剂：94ml TFA+2.5ml TIS+2.5ml H2O+1ml EDT，加入到反应器中，反应器置于20r/min的脱色摇床上，于-20℃冰浴条件下切割反应30min。多肽的沉降选用-20℃低温预冷的无水乙醚，离心沉降3次，得到乳胶状的粗肽样品。
将粗品冻干后称重，得到粉末状样品761mg，根据粗品的量和合成测定实际取代度（SD=0.36mmol/g）计算的理论量，计算粗品收率达到90.1%。
3、辛卡利特纯品多肽的纯化
用15%乙腈和水的混合溶液溶解辛卡利特粗品Ⅱ，经反相高效液相色谱法纯化得到辛卡利特多肽，纯化条件为：C4填料制备柱，流动相为A相：0.2%乙酸/水，B相：0.2%乙酸/乙腈，流速9ml/min，检测波长210nm，制备梯度程序
收集样品峰溶液，冻干后称重得样品为447.7mg，经分析计算，辛卡利特产品纯度达到99%，其纯品收率达到61.1%。
本发明利用Fmoc固相合成原理，开发了固相合成技术，采用常见易得、低成本的试剂缩合反应，采用冰浴切割技术进行多肽-树脂的切割，通过优化纯化工艺条件，使得辛卡利特粗品收率高达90%以上，其纯品收率达到60%，大大提高了辛卡利特的收率；本发明操作简单，反应过程取样方便，易于中控，并且合成周期短，生产成本低，副产物少，产品收率高，利于工业化生产。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。