亲和层析纯化抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白纯化领域，具体设及一种亲和层析纯化抗肿瘤坏死因子a单克 隆抗体的方法。
【背景技术】
[0002] 单克隆抗体在体内造影、体外诊断、人和动物的治疗W及工业上的应用范围越来 越广，特别在医药领域，美国FDA已批准几十种单克隆抗体药物，约有200多种单克隆抗体 药物在临床试验中。2012年，全球销售额前10位的药物中有6个是抗体药物，且前3位是 W肿瘤坏死因子a(TNFa)为祀点的抗体药物，其中包括阿达木单抗（adalimumab，商品名 Humira)。
[000引人肿瘤坏死因子-a化TNFa)是由S个17kDa蛋白质亚基组成的同源S聚体，是 由单核细胞和巨隧细胞分泌的炎性细胞因子，在多种细胞反应如坏死和调亡中作为信号传 递物起作用，参与炎性疾病、自身免疫病、细菌感染、癌症和退形性病变。对hTNF-a具有高 度选择性和反应性的单克隆抗体能够对上述疾病具有较好的治疗作用。
[0004] 单克隆抗体生产过程中的细胞培养阶段会引入多种杂质，需要进行有效地纯化过 程W得到目标抗体。单克隆抗体目前广泛采用=步纯化策略：粗纯（样品捕获）、中度纯化、 精细纯化。运=步每步承担着不同作用，样品捕获阶段，样品中大量杂质被有效去除，如杂 蛋白和核酸、内毒素和病毒，在初步纯化阶段，样品通过分离、浓缩和对目标产品进行稳定 化处理，在精细纯化阶段，为达到较高的纯度W及高质量的样品必须去除任何残留的微量 杂质。其中样品捕获阶段目前主流采用蛋白A亲和层析法，已知蛋白A可与多种哺乳动物 的IgG相结合，基质上的蛋白A配体能与抗体的Fc区形成可逆的特异性结合，竞争洗脱使 用特异性或非特异性配体洗脱条件，在上样过程中，目标抗体被结合，并W纯化或者浓缩的 形式被收集，同时部分杂质也会被去除。蛋白A亲和层析用于抗体捕获，一步工艺即可去除 细胞发酵液中大部分杂质，达到90%W上的纯度。
[0005] 亲和层析填料（ProteinA)的抗体动态载量值ynamicBindingCapacity,DBC)跟 上样的保留时间巧esidentTime,RT)正相关，保留时间长，载量高。随着抗体生产工艺规 模的扩大，细胞培养收获的上清液在亲和层析中的上样过程，成为最耗工时的部分，运是因 为，为了提高产能，现有技术均倾向于追求高动态载量来提高亲和层析填料的利用率，强调 增加保留时间的重要性，多采用低速恒速上样，运不可避免地增加了上样时间，延长了工艺 周期。对于稳定性差的细胞发酵液来说，必然会影响产品质量或增加后续纯化的生物污染 风险。另外蛋白A亲和层析填料价格昂贵，占抗体纯化工艺总成本的大部分，因此有必要对 亲和层析工艺进行研究W提高层析填料的效价比W及提高抗体的纯化效率，使工艺更适合 大批量抗体的纯化及制备，使生产的抗体更有市场竞争力。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种亲和层析纯化抗肿瘤坏死因子a单克隆抗体的方法，该方法 采用蛋白A为层析填料，上样阶段采用变速上样模式，能够充分利用填料的动态载量，提高 平均上样速度，减少整体上样时长，回收率和产品纯度均可达到90%W上，从而提高了整体 工艺效率，节约成本，适合工业大批量生产抗肿瘤坏死因子a单克隆抗体。
[0007] 本发明提供的亲和层析纯化抗肿瘤坏死因子a单克隆抗体的方法，其特征在于， 亲和层析填料为蛋白A填料，上样过程采用变速上样的模式。蛋白A填料选用了GE公司生 产的M油Select?树脂，同性能的蛋白A填料还有上海博格隆生物科技有限公司生产的BGL ProteinA树脂。
[000引装填M油Select?树脂蛋白A填料的层析柱可W采用柱体积小至几毫升的层析柱 进行小规模纯化，也可放大用于几升或几百升更大柱体积的层析柱用于大规模抗体纯化。 本发明采用2-lOml柱体积的层析柱进行研究。
[0009] 本发明所述的抗体为人源化的抗肿瘤坏死因子a单克隆抗体。实验采用的抗体 是用重组人TNFa来免疫BALB/c鼠获得的鼠单克隆抗体，通过基因改造制成的人源化抗人 TNFaIgGl单克隆抗体，由悬浮培养于无菌培养基中的哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢Cffi)) 所生产，其与TNFa的两个主要结合区域为Tyrl41巧yrl42和Lys90+Argl31。该抗体的制 造方法已公开在中国专利CN101111521中，其重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸 序列分别为该专利序列表中的SEQIDN0:36和SEQIDN0:39。
[0010] 本发明的方法首先要测定填料在不同保留时间下的动态载量值BC)。采用下表层 析条件，分别测定1. 2min、2. 4min、4min、6min、8min保留时间下的动态裁量，W上述保留时 间上样至层析柱，直至UV280达到10%背景穿透，结束上样。
[0011]
[0012] 测得上述各保留时间的动态载量结果如下：
[0013]
[0014]W保留时间（t)作为横坐标，动态载量值BC)作为纵坐标做散点图，添加截距 为O的3项式与散点最为接近的趋势线图（附图I)，并获得与其相应的=次方程y= 0. 2532x3- 3. 9502X2+19. 05x。
[0015] 不同保留时间下的动态载量结果也显示，随着保留时间的增加，动态载量也随之 增加。在1.2-4min保留时间范围内随着保留时间的延长，M油Select?动态载量有较明显 的升高，4minW上保留时间条件下MabSelect?的动态载量进入平台期，差别不大。
[0016] 根据体积流速的公式Q=CV/t，保留时间t与体积流速Q为反比关系，即保留时 间越长，体积流速越慢。我们选择设置3个不同的保留时间段即=种流速，高速保留时间段 (tA)为1. 2-2. 2min、中速保留时间段（te)为2. 5-4. 5min、恒速保留时间段（tc)为6min，并 把t,、te及t。保留时间段分别平均分成10个保留时间点，如表1所示：
[0017] 表1变速上样不同保留时间段选择
[0018]
[0019]将上述t&、te及tC各时间点代入S次方程y= 0. 2532X3- 3. 9502X2+19. 05x中， 计算出高速、中速、恒速S阶段各个保留时间下的动态载量DBCa、DBCe、DBQ，结果如下：
[002。 由附图1可知，保留时间在4-8分钟时间段的曲线出现了向下弯曲的形状，因此导 致此范围内计算出的动态载量略低于实际测定值。但是通过该=次方程仍然可W计算测量 范围内的任何一个保留时间下的理论动态载量仍可作为工艺参考。
[0022] 针对抗体纯化的特定条件（柱体积和待纯化细胞培养上清抗体表达量），根据不 同保留时间下的流速组合计算出该工艺对应的变速上样组合表。
[0023] 首先，根据体积流速的公式：Q = CV/t计算可得到不同保留时间下的体积流速 (其中Q为体积速度，CV为柱体积，t为保留时间）：
[0024]
[00巧]根据公式Tl= (CV*DBC)/Titer/Q计算得到不同保留时间下满载所需的上样时间 (其中：町为满载上样时间，DBC为不同时间下的动态载量，Titer为细胞培养上清抗体表达 量，Q为不同保留时间下的体积流速）：
[0026]
[0027] 根据公式：
[002引 1；恤邮打=[(：￥蝴齡恤)]/1'^6以9恤)+ [0^*值齡恤)-08(：恤)）]/1'^6以9恤)+ [(：￥*值齡任 )-DBC&">)]/Titer/Qw可计算得到变速上样不同保留时间阶段组合条件下所需的总时间。 [002引 其中：
[0030] L(AnBnc)为分别在t(An)、t(Bn)、t(口S阶段保留时间组合下的变速上样总时间；
[00引]CV为柱体积；
[00础DBC(An)、DBC(Bn)、DBC的为分别在t恤)、t(Bn)、t(c)S个保留时间下的动态载量；
[0033] Titer为细胞培养上清液抗体表达量；
[0034] Q(An)、Q(Bn)、Q(C)为分别在t恤)、t(Bn)、t(c)S个保留时间下的体积流速。
[0035] 不同上样速度组合下的上样总时间如下表所示：
[0036]
[0037] 计算所得表中最小值MIN[Tl(綱C)，Tlwbic)……L師0]，所对应的t恤)、t巧n)、t似二 个保留时间组合为总上样时间最短的变速上样组合。
[0038] W上述计算方法为依据，设计得出本发明的变速上样模式先后包括采用的柱保留 时间为1. 2-2. 2分钟的快速上样阶段，采用的柱保留时间为2. 5-4. 5分钟的中速上样阶段， 和采用的柱保留时间为6分钟的恒速上样阶段，实际实验操作印证所包含的变速上样组合 均能够大幅减少上样时长；优选的变速上样模式为先后包含快速、中速两个阶段，其中快速 上样阶段采用的柱保留时间为1. 2 -1. 5分钟，中速上样阶段采用的柱保留时间为2. 5 -3. 1 分钟；最优选的变速上样过程为先后采用柱保留时间为1. 2分钟的快速上样阶段和采用柱 保留时间为2. 7min的中速上样阶段。
[0039] 本发明提供了一种亲和层析纯化抗肿瘤坏死因子a单克隆抗体的方法，该方法 采用蛋白A为层析填料，蛋白A填料选用了 GE公司生产的M油Select?树脂，上样模式采用 变速上样方式，先后采用高速、中速、恒速=阶段或高速、中速两阶段对应的不同保留时间 的体积流速上样，结果发现，对相同量的抗体细胞培养上清液进行亲和层析，总上样时长相 比恒速上样能够缩短一半，而回收率和产品纯度相当，因此本发明的变速上样模式能够节 省整个亲和层析工艺时间，提高了纯化效率，节约了成本，适合工业大规模纯化抗体。
[0040] 下面结合【具体实施方式】的实施例及说明书附图做进一步说明。
[00川说明书附图
[0042] 附图1GEM油Select?填料理论动态载量趋势图
【具体实施方式】
[0043] 实施例1
[0044] 纯化条件：
[0045]层析柱：PP10/35(IOmm