一种抗pd-1的单克隆抗体及其获得方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗体工程技术领域，具体涉及全人源的抗ro-i的单克隆抗体、及其获 得方法与应用。
【背景技术】
[0002] 免疫调节在机体免疫应答过程中起着极其重要的作用，而免疫活性细胞的活化对 整个免疫应答的调节极其关键。研究表明，T细胞活化和增殖依赖于双重信号途径。"协同 刺激信号"的概念是1970年Bretscher和Cohn在T细胞活化双信号模型的基础上提出来 的，即T细胞的活化不仅需要通过APC递呈MHC-抗原肽复合物给抗原特异性T细胞来提供 第一信号外，还需要多种协同刺激分子参与提供辅助的第二信号（协同刺激信号）；随着研 究的深入，协同刺激信号逐渐成为免疫学的热点领域；这些协同信号分子主要包括CD28/ B7和TNFR/TNF两大超家族。ro-1/PD-Ll作为CD28/B7超家族的成员，能介导负性协同刺 激信号。ro-1/PD-Ll信号通路能有效抑制T、B细胞功能，使T细胞增殖受抑，同时减少细 胞因子IL-2、IL-IO和IFN-γ的分泌，在免疫调节中发挥着重要的作用，并在肿瘤免疫、自 身免疫、移植免疫、哮喘、病毒感染等疾病的研究中有着重要的意义。
[0003] Η)-1属于免疫球蛋白超家族I型跨膜蛋白，分子量约为50-55KD。最初是在凋亡的 T细胞杂交瘤中通过消减杂交技术得到的，因其与细胞凋亡有关故命名为程序性细胞死亡 因子l(Programmed Cell Death 1)。F1D-I的编码基因是Η)-〇)1，定位于人染色体2q37. 3， 和CTLA4基因具有23%的同源性。ro-1由胞内区、跨膜区和胞外区构成，其胞外区包含一 个免疫球蛋白可变区IgV样结构域；其胞内区N端的两个酪氨酸残基与其他氨基酸残基共 同组成了一个免疫受体酪氨酸抑制基序（Ι??Μ)，Ι??Μ通过酪氨酸的磷酸化发挥拮抗抗原 受体刺激信号的功能，从而在免疫应答过程中发挥负性调控功能；ro-i分子可在活化的T 细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和树突状细胞表面诱导性地表达，并与其配体ro-Li、ro-L2 相结合而对淋巴细胞的活化产生抑制作用，从而抑制免疫细胞的免疫应答反应。
[0004] PD-Ll (CD274或B7H1)和PD-L2 (CD273或B7DC)是PDl的两个配体，这两个配体基 因均定位于人染色体9p24. 2,并起始于同一方向，间隔42kb左右；它们同属B7家族，因而 同其他成员一样，在蛋白结构上ro-Li和ro-L2均由Igv样结构域、Igc样结构域、跨膜区 和短而保守的胞质区尾巴组成；与ro-L2相比，PD-Ll的胞质尾巴在不同种属间更为保守。 PD-Ll在活化的T细胞、B细胞、树突状细胞、单核细胞和多种类型的肿瘤细胞（如肺癌、肝 癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、鳞状细胞癌等）上诱导性表达；PD-L2主 要表达于活化的巨噬细胞、树突细胞和个别肿瘤细胞（如霍奇金淋巴瘤）上。肿瘤表面的 PD-Li与ro-i相互作用，可导致肿瘤抗原特异性T细胞凋亡，使肿瘤细胞逃脱机体免疫监 控。抗ro-ι的单抗通过阻断ro-1/PD-Li信号通路促进肿瘤抗原特异性τ细胞增殖，发挥 杀伤肿瘤细胞的作用，能有效提高免疫治疗效果，具有治疗多种类型肿瘤的潜力。
[0005] 目前多家大型国际制药公司都在进行针对ro-i或ro-Li的单抗药物（如表1所 示），其中百事美施贵宝的F 1D-I抑制剂Opdvio (Nivolumab)于2014年7月获日本批准上 市；默沙东的ro-1抑制剂于2014年9月获FDA批准上市；这两个药物的首个适应症均为黑 色素瘤。随着各公司临床项目的推进，适应症已扩展到肺癌、乳腺癌、血液癌症等领域。
[0006] 表1、当前正在开展临床实验的抗ro-i抗体
[0008] 目前全人源性抗体是治疗性抗体发展的主要方向，抗体库技术的出现为人源抗体 的制备筛选提供了良好的技术平台。抗体库技术绕过了以往单抗研制过程中必须的杂交瘤 过程，甚至不需要经过免疫过程即可获得各种抗体基因及抗体分子片段。噬菌体抗体库是 最早出现也是目前应用最广泛的抗体库。
[0009] 噬菌体展示技术是由Smith首先建立的一种将编码外源蛋白或多肽的基因插入 噬菌体衣壳蛋白基因，使外源蛋白或多肽与噬菌体衣壳蛋白融合表达于噬菌体表面的技 术。噬菌体抗体库就是利用了上述原理将不同特异性的抗体或其功能性片段（Fab、Fv、 ScFv)表达在噬菌体表面，再用抗原进行筛选。噬菌体抗体库根据抗体基因的来源分为免疫 库和非免疫库，非免疫库又包括天然库、半合成库和全合成库。噬菌体抗体库的筛选模拟了 抗体亲和力成熟的过程，通常将抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体抗体库，通过 数轮"吸附-洗涤-洗脱-扩增"的过程（即淘选）直至筛选到高亲和力特异的抗体。
【发明内容】
[0010] 本发明提供了一种抗ro-i的单克隆抗体；本发明从全合成抗体库中筛选出抗 ro-i的单克隆抗体，然后通过计算机辅助设计分析，构建小容量合成噬菌体抗体轻链库的 方法，对初筛获得的抗ro-l单克隆抗体DFPDl-I轻链的互补决定区⑶RU2、3区突变建库； 筛选后，选取亲和力较高的单克隆抗体DFPD1-3和DFPD1-7,再对其重链CDR1、2、3区突变建 库进行筛选，最终筛选到了高亲和力的抗ro-i的单克隆抗体。
[0011] 为实现上述目的，本发明一种抗ro-i的单克隆抗体的获得过程包括：
[0012] (1)、抗ro-i单链抗体的生物淘选，通过三轮抗体库的富集筛选，从全合成的ScFv 噬菌体库中获得了一种亲和力较高的抗体序列DFPD1-1，其重链为DFPDl-Hl (SEQ NO. 1)，轻 链为 DFPDl-Ll (SEQ NO. 5)。
[0013] (2)、以DFPDl-I为基础，通过计算机三级结构模拟，构建轻链互补决定区⑶RU2、 3突变库并对该抗体库进行生物淘选和阳性克隆的筛选及鉴定，获得了 6种不同轻链的抗 体序列 DFPD1-2、DFPD1-3、DFPD1-4、DFPD1-5、DFPD1-6、DFPD1-7,他们对应的轻链序列分别 为 DFPD1-L2(SEQ NO. 6)、DFPD-L3(SEQ NO. 7)、DFPD1-L4(SEQ NO. 8)、DFPD1-L5(SEQ NO. 9)、 DFPD1-L6(SEQ NO. 10)、DFPD1-L7(SEQ NO. 11);将上述7种单链抗体在噬菌体水平进行亲和 力比较。
[0014] (3)、选出两株亲和力较高的克隆DFPD1-3和DFPD1-7,构建重链互补决定区 CDR1、2、3库并对该库进行生物淘选和阳性克隆的筛选，获得了五种不同的单链抗体序列 DFPD1-9, DFPD1-10、DFPD1-11、DFPD1-12、DFPD1-13。其中 DFPD1-9、DFPDl-Il 和 DFPD1-12 的轻链可变区序列是DFPD1-L3,而DFPD1-10和DFPD1-13的轻链可变区序列是DFPD1-L7 ; DFPD1-9 和 DFPD1-10 的重链可变区序列是 DFPD1-H2(SEQ NO. 2) ,DFPDl-Il 和 DFPD1-13 的 重链可变区是 DFPD1-H3(SEQ NO. 3)，DFPD1-12 的重链可变区是 DFPD1-H4(SEQ NO. 4)。将 上述单链抗体在噬菌体水平上进行亲和力比较。
[0015] (4)、将（3)中所述单克隆重链可变区基因和轻链可变基因及轻重链恒定区基因 克隆到真核表达载体，转染宿主细胞，获得单克隆抗体的全抗再进行亲和力和其他生物学 功能比较。
[0016] 通过上述方法获得的抗ro-i的单克隆抗体，包括：轻链和重链；所述轻链的互补 决定区 CDRl、CDR2 和 CDR3 分别用 LCDRl、LCDR2 和 LCDR3 表示；LCDRl 包含 RASQNIHSYLD、 RASQNVSNWLD、RASQSIHNYLD、RASQDINNWLD RASQDVRTYLD、RASQGINSWLD 或 RASQSVSNYLD 中 的任一种；LCDR2 包含 EASTRAS、DASNRAT、NASTRAT、DASTLAT、GASTRAT 或 DASTRAT 中的任一 种；LCDR3 包含 QQALKLPIT、QQSRHIPLT、QQELHLPLT、QQNVNLPLT、QQDIDLPLT、QQSYRLPLT 或 QQNMQLPLT中的任一种。
[0017] 其中，所述轻链可变区氨基酸序列包含SEQ NO. 5、SEQ NO. 6、SEQ NO. 7、SEQ NO. 8、 SEQ NO. 9、SEQ NO. 10 或 SEQ NO. 11 中的任一种。
[0018] 通过上述方法获得的抗ro-i的单克隆抗体，包括：轻链和重链；所述重链的互补 决定区 CDRl，CDR2 和 CDR3 分别用 HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 表示；HCDRl 包含 SNNGMH 或 SNYGMH ; HCDR2 包含 VIWYDGSKK、VIWYDSSRK 或 VIWYDSTKK 中的任一种；HCDR3 包含 TAVYYCATNNDYW 或 TAVYYCATNTDYffo
[0019] 其中，所述重链可变区氨基酸序列包含SEQ NO. 1、SEQ NO. 2、SEQ NO. 3或SEQ NO. 4 中的任一种。
[0020] 其中，本发明还提供了一种包含上述轻链或上述重链的抗体、多肽或蛋白质。
[0021] 其中，本发明还提供了一种包含上述轻链或上述重链的抗体，所述抗体能够阻断 ro-i与其配体PD-Li的结合，抑制ro-i的生物学活性。
[0022] 其中，本发明还提供了一种包含上述轻链或上述重链的多核苷酸序列或组合。
[0023] 其中，本发明还提供了一种包含上述多核苷酸序列或组合的重组DNA表达载体； 所述载体的DNA序列中包含编码抗PDl抗