利用gst表达体系制备的mzf1-n端抗体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及利用GST原核表达体系制 备GST-MZFl融合蛋白的多克隆抗体及应用。
【背景技术】
[0002] MZFl蛋白（髓锌指基因1)属于锌指蛋白Kruppel转录因子家族的成员，包含13 个C2H2锌指结构。这些锌指结构均能结合至相应的DNA序列上从而调苄基因的表达。已知 MZFl是一个双功能的转录因子，它既可作为转录抑制子也能作为转录激活子调控细胞的分 化、迀移和增生。MZFl已经被证明对一些重要的蛋白的转录活性具有重要的调节作用。例 如：AR、PKM和P53等等。
[0003] 随着研究的深入我们对于MZFl蛋白功能及作用机制产生了更多的思考，如它是 否与生殖系统的发育及功能密切相关，它是否对肿瘤起抑制作用，它是否能够促进癌细胞 凋亡等等。而研究一种新的蛋白质的功能，抗体是最有力的工具之一，在蛋白质的检测 和功能研究中广泛应用的免疫组织化学、免疫印迹和免疫沉淀等一系列技术，都是基于抗 原-抗体相互作用发展起来的。因此我们制备的MZFl蛋白高效价抗体对于系统研究MZFl 在肿瘤细胞增殖和凋亡中的作用机制意义重大。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是建立一种能够用于MZFl蛋白的检测的模型，为从蛋白水平深入 研究MZFl蛋白功能及相关疾病提供必要的实验工具。
[0005] 利用基因工程技术，将MZFl蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段克隆到原核表 达载体PGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后，用重组质粒转化大肠杆菌BL21，并经异丙 基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG)诱导产生GST-MZFl融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新 西兰兔制备抗血清，并应用ProteinA/G将其纯化，获得多克隆抗体。抗体的效价及特异性 米用 ELISA 和 Western blot 检测。
[0006] 本发明的GST-MZFl融合蛋白是将利用特殊序列（MZFl蛋白N端128个氨基酸 对应DNA片段）构建MZFl融合蛋白原核表达载体，转化BL21得到的高效表达特异性的 GST-MZFl融合蛋白，这段N端128个氨基酸序列为：
[0007]
[0010] 这种GST-MZFl融合蛋白及其多克隆抗体制备包括以下步骤：
[0011] 第一步，克隆载体的构建
[0012] 从人MZFl基因全长上应用PCR技术以小鼠心脏基因组为模板，扩增得到的目的 片段与PMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。
[0013] 第二步，原核表达载体pG'EX-4T_l的构建
[0014] 将克隆质粒和质粒PGEX-4T-1双酶切后，利用回收试剂盒获得MZFl基因该区片 段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组的表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进 一步确定。
[0015] 第三步，GST-MZFl融合蛋白的诱导表达和纯化
[0016] 重组质粒PGEX-4T-1/MZF1转化大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导，GST-MZFl融合蛋 白的表达。以SDS-PAGE进行鉴定，，并优化表达条件，进行大量扩增诱导。用超声裂解细 菌，所获蛋白用Glutathione-Sepharose 4B柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯化产物。
[0017] 第四步，兔抗MZFl抗血清的制备及纯化
[0018] 以纯化的MZFl融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，初次免疫用500 μ g融合蛋白， 与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化后背部皮下多点注射。免疫前取耳静脉血分离血 清，作为免疫前的血清对照。2wk后进行第1次加强免疫，500 μ g纯化的GST-MZFl融合 蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混匀，前后四脚掌肌肉注射。之后每隔2wk加强免疫1次。 于末次免疫后Iwk取耳血，用ELISA法测定抗体的效价，当抗体效价达到1 : 100 000 时，颈动脉放血，收集血清。用ProteinA/G纯化抗hZimplO血清，准备蛋白A sepharose CL-4B亲和柱，亲和层析使抗体结合在柱子上，经2次洗涤后，将抗体洗脱，达到纯化目的， SDS-PAGE鉴定纯化产物，获得该发明的多克隆抗体。应用多种免疫学方法检测其效价及特 异性，结果显示该抗体可特异性的与MZFl蛋白结合。
[0019] 利用MZFl蛋白N端128个氨基酸基因序列成功地构建GST-MZFl融合蛋白原核表 达载体，转化BL21后可高效表达特异性的GST-MZFl融合蛋白。以该融合蛋白免疫兔子获 得抗GST-MZFl融合蛋白的高效价抗体经多种免疫学方法检测抗体效价及特异性，结果表 明抗体效价高达1:100 〇〇〇且特异性良好。抗体可应用于细胞中MZFl蛋白的检测并能有 效检出MZFl蛋白在不同细胞株中的差异表达，对于进一步探究MZFl蛋白在癌细胞中的表 达强度与肿瘤恶性程度的相关性上很有帮助，对于系统研究MZFl蛋白功能及其在肿瘤细 胞增殖和凋亡中的作用机制意义重大。另外，MZFl蛋白表达有不同的剪切体（isoform)，包 括全长和N-128缺失型等，我们制备的MZFl-N-128aa抗体为检测不同疾病条件下不同MZFl isoform表达并以此判定MZFl蛋白表达与疾病的关系奠定了基础。为应用该抗体建立一 种肿瘤恶性程度的检测模型提供了条件。
【附图说明】：
[0020] 图1为PCR扩增出的MZFl基因 N-128片段DNA琼脂糖凝胶电泳图；
[0021 ] 图2为双酶切质粒pGEX-4T-l和重组T载体琼脂糖凝胶电泳图；
[0022] 图3为pGEX-4T-l/MZFl重组体酶切鉴定结果；
[0023] 图4为纯化后的GST及GST-MZFl融合蛋白SDS-PAGE图；
[0024] 图5为ProteinA/G纯化后MZFl抗体和纯化前的抗MZFl血清SDS-PAG图；
[0025] 图6为间接ELISA法测定抗体的效价；
[0026] 图7为抗血清特异性的Western blot分析；
【具体实施方式】：
[0027] 实施例1:抗GST-MZFl血清的在制备
[0028] I. PCR-PMD18-T/MZF1 重组质粒的构建
[0029] MZFl基因全长从Genebank得到，基因序列号为NM003422。以小鼠心脏基因组为 模板，上游引物为5'-GAATCC ATGAGG CCTGCG GTGCTGG(含EcoRI酶切位点）；下游引物为 5' -CTCGAG CTATCC GCCCGG CTCCCG (含 XhoI 酶切位点）。应用 PCR 成功扩增出了 MZFl 基 因 N端128个氨基酸对应DNA序列长度384bp【图1】。扩增得到的片段与PMD18-T载体连 接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5a中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解 法小提重组质粒后，以EcoR I和Xhol I双酶切鉴定。
[0030] 2.原核表达载体pGEX-4T-l的构建
[0031] 将含有MZFl基因 N-128片段的pMD18-T质粒经EcoR I和Xhol双酶切后（片 段约0.4kbp)，利用回收试剂盒获得MZFl基因该区片段，同时用相同的酶处理质粒 PGEX-4T-1 (约4.9kbp)【图2】。然后将回收的MZFl基因 N-128片段和经酶切的载体 PGEX-4T-1在T4 DNA连接酶作用下于16°C连接过夜。酶切鉴定重组体，结果显示该MZFl 基因 N-128片段正确【图3】。
[0032] 3. GST-MZFl融合蛋白的诱导表达和纯化
[0033] 重组质粒PGEX-4T-1/MZF1转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落接入LB/Ampr培养基 中，37°C振摇培养过夜。次日，将培养物按1 : 50的比例转接于含Amp+的LB培养基中， 继续在37°C摇床培养至对数生长中期。在培养液的A600为0. 5~0. 6时，加入IPTG至 终浓度为〇.〇8mmol/L，不加入IPTG者为阴性对照，置25°C继续培养4~5h。离心收集菌 体，以SDS-PAGE进行鉴定GST-MZFl融合蛋白的表达，并优化表达条件，进行大量扩增诱 导。以5000r/min于4°C离心5min，收集菌体，用60mL冰预冷的NETN悬浮IL菌液的沉淀。 用超声裂解细菌，再以9600rpm,于4°C离心15min,取上清，过Glutathi