鸭rig-1多克隆抗体及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和如SEQ ID NO:3所示的多肽以及利用这些多肽制备鸭RIG?1多克隆抗体的方法及所得多克隆抗体。本发明所得抗体可达到进行Western Blot检测和免疫组化检测的要求，可定性和定量检测鸭组织中的RIG?1。
【专利说明】
鸭RIG-1多克隆抗体及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及鸭RIG-1多克隆抗体及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 天然免疫系统是动物抵御病原入侵的第一道防线，模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs)是天然免疫系统的重要成分，在动物机体的抗病毒免疫反 应中发挥重要作用。一系列模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)对病原 体的识别启动了机体的抗病毒免疫机制。PRRs主要包括膜结合受体，如Toll样受体(1'〇11_ 1 ike receptors，TLRs)，另一类是细胞内模式识别受体，包括核苷酸寡聚化域样受体 (nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)和维甲酉爱诱导基 因 I样受体（the retinoic acid inducible gene-I-like receptors，RLRs)。维甲酸诱导 基因 l(RIG-l)是RLRs家族的重要成员，属于胞内识别受体，能有效地识别逃避细胞膜上 TLRs识别而入侵到细胞质中的病毒RNA，通过信号通路级联放大作用诱导细胞因子、趋化因 子和干扰素（11^6奸61'011，正1'〇等的产生 。
[0003] 从目前的研究来看，RIG-1可能是水禽类动物或鸽子能抵抗流感病毒的原因之一。 然而，现有的相关研究还不多。虽然有少量研究发现在一些物种上的RIG-1对于禽流感病毒 和法氏囊病病毒具有一些联系，但由于缺乏相应的对RIG-1天然蛋白的检测手段，阻碍了进 一步的研究。
[0004] 因此，寻求一种能够用于鸭组织RIG-1的定性和定量检测的多克隆抗体，对于研究 鸭的抗病毒免疫系统及开发相应医药用产品而言显得极为迫切。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种分离的多肽，该多肽的序 列如SEQ ID N0:1所示。
[0006] 本发明的另一目的在于提供提供一种分离的多肽，该多肽的序列如SEQ ID N0:2 所示。
[0007] 本发明的另一目的在于提供提供一种分离的多肽，该多肽的序列如SEQ ID N0:3 所示。
[0008] 本发明的另一目的在于提供编码上述任一多肽的多核苷酸序列。
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种制备鸭RIG-1多克隆抗体的方法，该方法包括使 用上述任一种分离的多肽免疫哺乳动物。
[0010]如本发明的一个实施例所示，本发明所得的多克隆抗体可以用于Western Blot检 测和免疫组化检测，可以用于后续更为深入的研究和相应产品的开发。
[0011]在一个具体实施例中，所述方法包括如下步骤：
[0012] (1)人工合成多肽，所述多肽的序列如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3 所示；
[0013] ⑵纯化多肽；
[0014] (3)使用所得多肽免疫哺乳动物，并从哺乳动物中纯化抗体，得到所述多克隆抗 体。
[0015] 值得指出的是，本发明对于人合成所述多肽的方法并无特别的限制。本发明实施 例中的合成方法仅仅提供其中的一种具体方法，本领域技术人员可以在本发明的基础上， 对各步骤参数进行合理的调整。
[0016] 本发明的另一个目的在于提供由上述方法制备得到的多克隆抗体。
[0017] 本发明的有益效果：
[0018] 本发明所得抗体可达到进行Western Blot检测和免疫组化检测的要求，可定性和 定量检测鸭组织中的RIG-1。
【附图说明】
[0019] 图1为血清Western Blot实验和Block验证实验结果图；
[0020]图2为兔血清RIG-1多克隆抗体纯化图；
[0021]图3为纯化抗体蛋的Western Blot检测结果；
[0022] 图4为免疫组化实验结果，其中，（1)图A~D为1日龄法氏囊组织，B、D分别为A、C的 阴性对照，A、B放大倍数为200，C、D放大倍数为400;(2)图E~Η为4周龄法氏囊组织，F、Η分别 为E、G的阴性对照，E、F放大倍数为200，G、H放大倍数为400; (3)图I~J为4周龄脾脏组织，J、 L分别为I、K的阴性对照，I、J放大倍数为200，K、L放大倍数为400。
【具体实施方式】
[0023] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0024] 本发明的实施除非另外说明，将使用本领域技术人员已知的化学、生物化学和免 疫学的常规方法。这些技术在文献中有完整的解释。参见，如《基础免疫学》(Fundamental Virology)，第二版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编）；《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology)，第I-IV卷（D·Μ.Weir和C·C·Blackwel1编，Blackwel1 Scientific Publ i cat ions); T · E · Creighton，《蛋白质：结构和分子特性》（Proteins : Structures and Molecular properties)(ff.H.Freeman and Company，1993); A.L.Lehninger，《生物化学》（Biochemistry) (Worth Publishers，Inc ·最新版）；Sambrook 等，《分子克隆：实验室手册》（Molecular Cloning: a Laboratory Manual)，第二版，1989; 《酶学方法》（Methods in Engymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press， Inc.)〇
[0025] 实施例1
[0026] 多肽的合成
[0027] 设计并在体外合成3段多肽序列，分别为SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 1所示。
[0028] 具体步骤如下；
[0029] 1、树脂的称取:将称取好的树脂放入反应柱里面，然后用DCM溶胀半个小时。DCM加 的量为树脂高度的2~3倍，也就是把树脂充分溶胀完全。可以微量鼓气。
[0030] 2、去保护:先把DCM抽干，然后用DMF洗涤3遍，去除DCM，然后用20%六氢吡啶去保 护，5+10即共两遍，第一遍5分钟，第二遍10分钟，中间用DMF洗涤一遍。
[0031] 3、去保护后洗涤:用DMF洗涤6遍。
[0032] 4、偶联:按照3倍量投氨基酸，如0.2mmol的树脂，我们投氨基酸的量为0.2mmol*3 = 0.6mmol乘以其分子量就是要称取的质量。此外我们还要称取激活剂。
[0033] 5、偶联时检测：用滴管取树脂（少许，约15粒左右，只要检测可以辨认即可)与小试 管中，分别滴加2滴A液、2滴B液、2滴C液，放到加热3分钟。然后取出来看树脂是否透明，如溶 液颜色深影响观察，可以倒掉溶液，加少许DMF洗净，再观察。若树脂检测透明，即可以偶联 下一个氨基酸。若树脂不透明，延长反应时间，若还不透明，可以进行复投。一定要保证每一 步都反应完全再偶联下一个氨基酸。
[0034] 6、偶联后洗涤:偶联完毕后，DMF洗涤3遍。
[0035] 7、以上是偶联一个氨基酸的步骤，接下来依稀依次类推，也就是重复第3步骤一一 第6步过程直到最后一个氨基酸偶联完毕。
[0036] 8、最后一个氨基酸偶联好后，再去保护，去保护完后收缩，DMF洗涤3遍，DCM3遍，甲 醇3遍，抽干肽树脂。
[0037] 9、称取完成的干肽树脂，装入15ml或50ml的离心管中，加入裂解液(每克10倍ml) 如：lg肽树脂加 l〇ml的裂解液。反应2个小时，每10~15分钟摇荡一下，让其充分反应，可放 入摇床中。温度最好控制再25 °C左右。反应好后，抽滤，溶液倒入冰乙醚中沉淀，然后离心， 离心时要平衡。一般离心3~4遍。
[0038] 10、抽干:把离心好后的肽先放通风橱中吹一会，然后放入真空干燥器中抽干。 [0039] 11、取少量到样品管中，进行质谱检测，正确多肽进行HPLC纯化。
[0040] 实施例2
[0041] 将上述所得三条多肽分别免疫两只兔子，11周后分别收集每只兔子的血清进行 ELISA检测，具体实验步骤如下：抗原先以lyg/mL的浓度包被，4°C包被过夜；然后加入1 % BSA，37°C 下孵育 1 小时；兔多抗血清分别以 1:200，1:1000，1:5000，1:10000，1: 20000，1: 60000,1:240000等稀释度稀释，稀释后样品以50yL/孔加样，放在37°C下孵育1小时;然后用 TBST以200yL/孔洗涤2遍后，加入HRP标记的羊抗兔二抗，稀释5000倍后使用;在37°C下孵育 45分钟后，用TBST以200yLl/孔洗涤3遍;再以lOOyL/孔加入TMB显色液，静置5分钟；最后使 用酶标仪测定〇D450nm读书并记录数据。
[0042]通过ELISA检测各多肽免疫兔子产生可能目的蛋白的相对浓度，详细数据如表1所 不。
[0043]表 1
[0044]
[0046] 实施例3
[0047] Western Blot检测与Block验证
[0048] 使用各兔子血清，应用Western Blot方法分别检测鸭法氏囊(F)、脾脏(P)组织中 RIG-1蛋白，实验步骤如下：使用4%的浓缩胶和8%的分离胶，上样后先150V电压至样品跑 平，然后调小电压到80V，以裂解液中的指示剂溴酚蓝跑出玻璃板的下沿时停止电泳;取出 凝胶进行转膜，条件为75V、90min;然后将各血清用脱脂奶粉稀释200倍后，加入适量于膜 上，室温孵育2小时;使用TBST洗涤5次，每次10分钟；加入适量稀释5000倍后的HRP标记羊抗 兔二抗，放入室温孵育1小时;使用TBST洗涤5次，每次10分钟;最后膜于暗室中化学发光检 测试剂(ECL)反应3分钟后放入已经铺好保鲜膜的暗盒中，包好PVDF膜，暗室中用柯达X胶片 曝光1分钟。
[0049] 血清Block检测验证反映呈阳性的条带极为目的蛋白，具体步骤和Western Blot 实验大体一致，只将加入一抗那一步改为：设置正常检测组与Block检测组，在正常检测组 中加入lml 5%脱脂奶粉与2μ1血清;在Block检测组中加入950μ1 5%脱脂奶粉，50μ1该项 目多肽（多肽浓度为lmg/mL)与2ul血清。此时不要马上加入膜，让多肽与血清先反应结合1 小时，再加入膜反应1小时。
[0050]分离6只兔子血清，分别用第4周鸭子脾脏和法氏囊组织蛋白样品进行Western Blot实验，结果显示只有编号5427兔子的血清在脾脏组织蛋白中的阳性蛋白条带与预测 RIG-1 蛋白大小相近（106KD，http: //web · expasy · org/protparam/ )，具体结果如图 1A 显示。 然后使用5427兔的血清在脾脏组织蛋白中进行Block实验，结果显示目的蛋白条带符合 RIG-1目的蛋白大小；阴性对照（图1B左）中相对于阳性对照（图1B右）中的相同位置没有蛋 白条带，说明目的条带不是假阳性。
[0051 ] 实施例4
[0052] 将制作好的亲和层析柱依次用20mL纯水和1 xroS(pH7.4)，流速70mL/h充分清洗； 然后将纯化的血清10mL置于50mL离心管中，用孔径0.45μπι，直径25mm微孔滤膜抽滤;将抽滤 过的血清样品以40mL/h流速上样，重复一次；用20mL 1 X roS(pH7.4)以70mL/h的流速清洗 柱子，清洗过程中调节仪器透光率(T档)示数为100, 10min后连接蛋白检测仪。调节蛋白检 测仪吸光率(1A档)示数为0，此时打开电脑桌面的HD-A电脑采集器，并将满屏量程调到5，用 甘氨酸溶液(pH 2.7，0.2M)以40mL/h的速度洗脱抗体，此时按下绿色的洗脱记录按钮开始 洗脱，当仪器的示数开始升高时开始收集抗体。并在抗体收集过程中以1M的碳酸氢钠及时 调节抗体的pH值至7左右，并记录洗脱峰的最高峰值;抗体收集完后，调节pH值至7左右，并 记录洗脱的抗体体积，之后用纯净水冲洗连接收集器的橡胶管;依次用20mL 1 X PBS和纯水 以70mL/h的速度清洗亲和层析柱，之后加入20 %乙醇，封口，4°C冰箱保存。
[0053] 如图2所示，抗体纯化峰图为单峰，表明纯化得到蛋白为单一抗体蛋白，纯度较高， 符合要求。
[0054] 实施例5
[0055] 纯化抗体用于鸭多种组织中RIG-1天然蛋白的检测
[0056] 1、ELISA检测纯化抗体蛋白，确定蛋白相对浓度
[0057] 结果显示纯化抗体蛋白试剂中IgG浓度为0.36mg/mL，稀释比例为1:10000时，检测 值为0.873,符合要求。
[0058] 表3纯化抗体Elisa检测结果
[0059]
[0061] 2、纯化抗体蛋白分别用于法氏囊和脾脏组织蛋白样品的Western Blot实验验证
[0062] 如图3所示使用纯化抗体蛋白，在第4周鸭脾脏和法氏囊组织蛋白样品中均有阳性 目的条带，说明纯化抗体可以适用于Western Blot检测。
[0063] 3、纯化抗体蛋白分别用于第1周和第4周的鸭法氏囊和第4周的脾脏蛋白样品的免 疫组化实验验证，具体步骤如下:组织样品被包埋成石蜡块后被切成石蜡切片;石蜡切片完 全烘干后进行脱蜡，然后放入0.3%过氧化氢甲醇溶液，室温避光孵育10分钟;将玻片置于 PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次3分钟；再将切片用EDTA缓冲液进行抗原修 复，100 °C20分钟;然后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次3分钟；切 片稍甩干后，纯化蛋白抗体用1%BSA稀释50倍后滴加于切片，放在湿室内室温孵育1小时； 切片稍甩干后再圈内滴加组化试剂盒内反应增强液，室温孵育10分钟；切片稍甩干后滴加 组化试剂盒内酶标羊抗兔IgG聚合物覆盖组织，室温孵育30分钟;PBS洗涤3次，每次3分钟， 切片稍甩干后滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水 冲洗切片终止显色;苏木素复染4分钟左右，自来水洗，促蓝液促蓝lmin，自来水冲洗;最后 进行脱水，然后用中性树脂封片。
[0064] 如图4所示，在第1日龄、4周龄法氏囊组织和第4周龄脾脏中，用纯化抗体可以检测 到RIG-1表达，呈黄褐色，而在其对应的阴性对照当中没有显示黄褐色，说明纯化抗体可以 适用于免疫组化。
[0065]
[0066]
[0067]
[0069
【主权项】
1. 一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -种分离的多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID N0:2所示。3. -种分离的多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID N0:3所示。4. 分离的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列编码权利要求1-3任一项所述 的多肽。5. -种制备鸭RIG-1多克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-3 任一项所述分离的多肽免疫哺乳动物。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1) 人工合成多肽，所述多肽的序列如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3所示； (2) 纯化多肽； (3) 使用所得多肽免疫哺乳动物，并从哺乳动物中纯化抗体，得到所述多克隆抗体。7. 根据权利要求5或6所述方法制备得到的多克隆抗体。
【文档编号】C07K16/28GK106008696SQ201610519562
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】刘贺贺, 罗俊, 张涛, 王继文, 李亮, 韩春春, 甘心梦
【申请人】四川农业大学