一种柠檬黄多克隆抗体的制备方法与流程

本发明属于酶联免疫技术领域，具体的说是涉及一种柠檬黄多克隆抗体的制备方法。

背景技术：

柠檬黄又称酒石黄、酸性淡黄、肼黄。柠檬黄之所以能用做食品药品染色剂，是因为它安全度比较高，基本无毒，不在体内贮积，绝大部分以原形排出体外，少量可经代谢，其代谢产物对人无毒性作用。而它的生产所用原料对氨基苯磺酸、酒石酸及2-萘酚-6-磺酸都是基本无毒的物质。因此，世界粮农组织(fao)和世界卫生组织(who)早在1994年就给了它一个很宽容的每日答应摄用量。若按标准使用柠檬黄，则进入人体的量距每日答应摄用量相差很多。

柠檬黄为一种偶氮型酸性染料，其主要用于食品、饮料、药品及化妆品的着色，也用于羊毛、蚕丝的染色及制造色淀。水溶性合成色素，鲜艳的嫩黄色，广泛用于冰淇淋、雪糕、果冻、酸奶、饮料、罐头、糖果包衣等的着色。根据中国《食品添加剂使用卫生标准》(gb2760-1996)规定：用于高糖果汁(味)或果汁(味)或果汁(味)饮料、碳酸饮料、配制酒、糖果、糕点上彩装、西瓜酱罐头、青梅、虾(味)片、渍制小菜、红绿丝，最大使用量0.1g/kg；用于冰淇淋，最大使用量0.02g/kg。用于植物蛋白饮料、乳酸菌饮料，最大用量0.05g/kg。

食用酒石黄人工色素会导致儿童智商降5分，以往的研究显示，食品中的人工添加剂会引发儿童行为障碍。英国南安普敦大学的一项研究结果更发现，食用人工色素会影响儿童智力发育。新华网引述英国《每日电讯报》报导，英国南安普敦大学应英国食品标准局请求，进行食用人工色素对儿童发育影响的研究，整个研究耗资75万英镑。研究结果发现，包括酒石黄和日落黄在内的7种人工色素可能会使儿童智商下降5分。

鉴于柠檬黄给人类带来健康的潜在风险，开发一种简单、快捷制备用于检测柠檬黄的多克隆抗体显得尤为重要。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种柠檬黄多克隆抗体的制备方法。

本发明提供的技术方案为：

一种柠檬黄多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将制备好的全抗原注射到免疫动物体内；

(2)再加强免疫3次后采血，检测血清效价；

(3)若血清效价达到要求，则大量采血，离心取上清，得到抗血清；

(4)将所得抗血清流过抗原免疫亲和填料柠檬黄-agarose，血清中的抗柠檬黄抗体与偶联在填料上的柠檬黄特异吸附，洗掉杂质，用弱酸洗脱，即得到抗柠檬黄多克隆抗体。

作为优选，步骤(1)中所述的全抗原包括柠檬黄-klh和柠檬黄-bsa。

作为优选，所述的全抗原的制备方法，包括以下步骤：

(1)先将柠檬黄溶解于n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，然后加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，混匀直到全部溶解，再加入n,n'-二环己基碳二亚胺dcc，室温摇床反应30min，得到柠檬黄-nhs中间体；

(2)取血蓝蛋白klh或牛血清蛋白bsa，分别溶解在0.1mol/l的磷酸二氢钠溶液中；

(3)将柠檬黄-nhs中间体和bsa或klh混匀，室温摇床震荡反应2h，经g25sephadex脱盐后，制得的柠檬黄-klh疫苗和柠檬黄-bsa疫苗。

作为优选，所述的全抗原柠檬黄-klh做注射用；所述的全抗原柠檬黄-bsa做检测包被用。

作为优选，步骤(1)中所述的免疫动物为新西兰大白兔。

作为优选，步骤(4)中所述的抗原免疫亲和填料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将柠檬黄溶解于n，n-二甲基甲酰胺(dmf)，然后加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，混匀直到全部溶解，再加入n，n'-二环己基碳二亚胺dcc，室温摇床反应30min，得到柠檬黄-nhs中间体；

(2)取赖氨酸琼脂糖磁珠agarose中，用0.1mol/l磷酸二氢钠清洗后加入与agarose等体积的丙酮；

(3)将制备好的柠檬黄-nhs中间体加到赖氨酸agarose丙酮-磷酸二氢钠悬浮中摇床反应过夜，得到柠檬黄-agarose；

(4)用100ml丙酮清洗柠檬黄-agarose，再用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液pbst清洗，自然滴干后，即得抗原免疫亲和填料柠檬黄-agarose。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的方法用柠檬黄制备的柠檬黄-nhs中间体半抗原后，以柠檬黄-nhs中间体半抗原为配体偶联到琼脂糖上制备抗原免疫亲和填料，用此填料可以在保证抗体活性的情况下快速纯化出特异性抗体。

(2)本发明的方法制备出的柠檬黄多克隆抗体具有高特异性、高亲和力的优点，有很强的应用前景及应用价值。

(3)本发明的方法中柠檬黄的抗原是用柠檬黄制备柠檬黄-nhs中间体半抗原，再在酸性条件下将柠檬黄-nhs半抗原结合载体蛋白制备全抗原免疫动物，产生高效价的抗体。

附图说明

图1为抗柠檬黄多克隆抗体间接elisa的效价图；

图2为抗柠檬黄多克隆抗体间接竞争elisa的ic50图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

实施例1：抗柠檬黄多克隆抗体的制备

1.1柠檬黄抗原的制备

1.1.1称取50毫克柠檬黄，溶解于2mldmf，然后加入50mg的nhs，混匀直到全部溶解。加入100mg的edc，室温摇床震荡反应30min得到柠檬黄-nhs中间体。

1.1.2称取100mgklh和50mgbsa，分别溶解在10ml和5ml0.1mol/l的磷酸二氢钠溶液中。

1.1.3取步骤1.1.1所制备的柠檬黄-nhs中间体1.2ml滴入1.1.2步骤所制备的klh中，0.8ml于bsa中，室温摇床震荡反应2小时。

1.1.4用g25sephadex分别脱盐，然后其检测蛋白浓度，所制得的柠檬黄-klh用于免疫注射，柠檬黄-bsa用于检测包被用。

1.2柠檬黄抗原免疫亲和填料的制备

1.2.1取2g赖氨酸溶于10ml0.1mol/l碳酸钠，充分溶解后加入到25ml过碘酸钠氧化的琼脂糖填料中混匀，60℃反应5min，摇匀再次反应10min，转4℃静置20min，然后加入硼氢化钠100mg混匀还原，室温摇床上摇动过夜，得到赖氨酸琼脂糖填料；

1.2.2将25ml的赖氨酸琼脂糖填料转移到50ml洁净的空柱子，用100ml0.1mol/l磷酸二氢钠清洗，自然滴干后加入25ml的丙酮。

1.2.3称取50毫克柠檬黄，溶解于2mldmf，然后加入50mg的nhs，混匀直到全部溶解。加入100mg的edc，室温摇床震荡反应30min得到柠檬黄-nhs中间体。

1.2.4将步骤1.2.3所制得的柠檬黄-nhs中间体边振荡边加入至1.2.2步骤制得的重悬好的赖氨酸琼脂糖填料，盖紧，室温摇床摇动避光反应过夜。

1.2.5自然滴干去除琼脂糖填料中的液体，用100ml丙酮清洗填料后再用200mlpbst清洗。自然滴干后所得的柠檬黄-agarose填料可用于柠檬黄抗体的纯化。

1.3抗柠檬黄多克隆抗血清制备

用新西兰大白兔为免疫动物，疫苗浓度配成1mg/ml，首次免疫用0.5ml疫苗加0.5mlpbs加1ml完全佐剂混匀多点注射，加强免疫用0.25ml疫苗加0.75mlpbs加1ml不完全佐剂混匀分2点注射，首次免疫后，每间隔2周加强免疫1次，35-40天采集0.5ml血清检测滴度，用配对检测抗原包被做血清的间接elisa检测，血清滴度达到1：6400后进行大量血清制备。

1.4抗柠檬黄抗体提取、纯化

将150ml的免疫血清流过步骤1.2所制的柠檬黄-agarose填料装成的亲和柱。依次用10倍填料体积的pbst、10倍填料体积的1mol/l氯化钠清洗掉杂质后，柱上的特异性柠檬黄抗体用1.5％乙酸洗脱。

实施例2：抗柠檬黄多克隆抗体的检测

2.1效价检测

用间接elisa法对抗体进行检测。所用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg，阴性对照为pbst溶液。以阴性od值不大于0.15，以最大od值的一半对应的抗体浓度为抗体效价。检测结果见表1，以柠檬黄抗体浓度为x轴，以od值的百分比为y轴做图(见图1)。

表1间接elisa检测抗柠檬黄抗体效价结果

从表1检测结果可以看出，本发明的方法制备的抗柠檬黄多克隆抗体效价较高，达到45ng/ml。

2.2抗体敏感度测定

用间接竞争elisa法对抗体敏感度进行测定。所用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg，用柠檬黄标准品浓度从低到高去竞争酶标孔中的抗体，其od值与所加入的柠檬黄标准品浓度呈负相关。以od信号抑制率为50％所对应的标准品浓度为敏感度的判断依据。检测数据如表2，以柠檬黄标准品浓度为x轴，以od值的百分比为y轴做图如图2。

表2间接竞争elisa检测抗柠檬黄抗体敏感度结果

从表2可以看出，本发明的方法制备的抗柠檬黄多克隆抗体敏感性很好，达到26.52ng/ml。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。