猪Six1蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法
【专利摘要】本发明公布了一种猪Six1蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法。通过设计引物克隆猪Six1基因；大肠杆菌重组表达载体pET-30a(+)-pSix1的构建；将构建的重组表达载体pET-30a(+)-pSix1转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建表达猪Six1蛋白的重组菌株；对重组菌株进行优化诱导表达条件，纯化重组猪Six1蛋白；以纯化的重组猪Six1蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备猪Six1多克隆抗体。通过本发明的方法，实现了猪Six1蛋白的体外表达和制备出了效价高、特异性好的猪Six1多克隆抗体，完全可以满足相关实验的需要。
【专利说明】猪Sixl蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，具体来说是一种猪SiXl蛋白的体外表达及其多 克隆抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，在猪的饲养过程中追求猪的快速生长率和瘦肉率导致猪肉品质的下降， 这与消费者日益增长的肉质要求不相符合。肌纤维类型与猪肉品质密切相关，慢速氧化型 肌纤维有助于猪肉嫩度和多汁性。因此，提高慢速氧化型肌纤维在肌肉中的比例可有效地 改善猪肉品质。
[0003] Sixl属于Six转录因子家族重要成员，在骨骼肌早期肌源细胞决定和迁移、肌纤 维形成和肌细胞增殖中起着重要作用。它可作为生肌决定因子家族的转录调节因子，调控 肌纤维增殖和分化，并在肌纤维类型的决定过程中起着重要作用，是一种快肌纤维基因，可 诱导慢肌纤维向快肌纤维的转化，参与肌纤维类型转化的调节，影响肌肉中快肌纤维和慢 肌纤维的比例，进一步影响猪肉品质。天然的猪Sixl蛋白存在于多种器官组织中，以骨骼 肌中的含量最丰富，其次为睾丸和骨髓，但分离纯化出组织中的猪Sixl蛋白技术难度较 大，而化学合成成本过高，所以利用基因工程技术制备重组猪Sixl蛋白是解决上述问题的 一个有效途径。
[0004] 利用基因工程技术，以微生物为载体的原核表达系统生产外源蛋白具有广阔的应 用前景，尤以大肠杆菌为宿主的原核表达系统是目前为止研究的最清楚的一套原核表达系 统之一，因其遗传背景和生化特性清楚、具有生产周期短、成本低、表达量高、表达产物分离 纯化相对简单和便于工业化生产等优点，适于外源蛋白的表达，广泛应用于生产外源蛋白 的实践中。
[0005] Sixl作为肌纤维类型的重要调控因子和猪肉品质的潜在影响因子，目前，市场上 多针对人、小鼠及大鼠 Sixl抗体，这些抗体与猪、牛、羊、兔、猴等有一定的交叉反应，但是 针对猪Sixl的效价高、特异性好的抗体还没有。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种简单易操作，能体外表达出猪Sixl蛋白及其制备多克 隆抗体的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种猪Sixl蛋白的体外表达方法， 包括下列步骤：
[0008] (1)提取猪背最长肌总RNA ;
[0009] (2)构建用于表达猪Sixl蛋白的大肠杆菌重组表达载体；
[0010] (3)将重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，构建携带重组表达载 体的基因工程菌；
[0011] (4)培养基因工程菌至OD6c?达到0. 4?0. 6,加入诱导剂IPTG，诱导猪Sixl基因 在该基因工程菌中表达；
[0012] (5)纯化表达系统表达的重组猪Sixl ;
[0013] (6)重组猪Sixl蛋白表达形式的鉴定。
[0014] 进一步的，步骤（2)中，构建载体时，克隆猪Sixl基因的插入位点为Nde I和Xho I酶切位点。
[0015] 进一步的，步骤（2)中，构建载体时，所用的引物序列如下所示：
[0016] 上游：5, -CCCAATTCCATATGTCGATGCTGCCATCGTTCGGCTTC-3'
[0017] 下游：5' -AAACTCGAGGGACCCTAAGTCCACCAGACTGGAG-3' ；
[0018] PCR反应条件为：95°C预变性3min，然后95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸 lmin，共进行35个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0019] 进一步的，步骤（4)中，诱导剂IPTG浓度为2mmol/L，诱导时间为2小时。
[0020] 进一步的，步骤（5)中，所述纯化是用镍柱亲和层析法中的变性条件方法进行纯 化。
[0021] 进一步的，步骤（6)中，所述重组猪Sixl蛋白表达形式的鉴定为超生破碎法，其中 超声破碎功率为260W，超声破碎2秒，间隔5秒，作用30分钟，并经SDS-PAGE电泳分析。
[0022] 本发明的第二目的是提供一种猪Sixl蛋白，该重组猪Sixl蛋白C端带有6个组 氨酸标签。
[0023] 本发明的第三目的是提供一种猪Sixl多克隆抗体的制备方法，其特征是：挑取构 建含有携带重组表达载体的基因工程菌，接种到4ml含有浓度为50 μ g/ml的卡那霉素的液 体LB液体培养基中，37 °C、250rpm振荡培养过夜活化，将活化的基因工程菌按1 %接种于 50ml含有浓度为50 μ g/ml的卡那霉素的LB液体培养基，37°C、250rpm振荡培养至0D_为 0. 4-0. 6时加入IPTG，使其终浓度为2. Ommol/L，30°C诱导2小时，菌液离心，收集菌体，经裂 解、纯化后收集蛋白，将纯化后重组猪Sixl蛋白作为抗原免疫Sprague-Dawley大鼠，免疫 前断尾采血2ml，收集血清作为阴性血清，300 μ g重组猪Sixl蛋白与等体积的弗氏完全佐 剂乳化后免疫大鼠，2周后用200 μ g重组猪Sixl蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后免 疫大鼠，每隔10天再次加强免疫，共4次免疫，最后一次免疫7天后采血，收集抗血清。
[0024] 本发明的有益技术效果是：在本发明的技术方案中，通过设计引物克隆猪 Sixl基因：大肠杆菌重组表达载体pET-30a(+)-pSixl的构建；将构建的重组表达载体 pET-30a(+)-pSixl转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建表达猪Sixl蛋白的重组菌株；对重 组菌株进行优化诱导表达条件，纯化重组猪Sixl蛋白，以纯化的重组猪Sixl蛋白为抗原， 采用常规多克隆抗体制备方法制备猪Sixl多克隆抗体。通过本发明的方法，实现了猪Sixl 蛋白的体外表达和制备出了效价高、特异性好的猪Sixl多克隆抗体，完全可以满足相关实 验的需要。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
[0026] 图1是PCR扩增猪Sixl基因的琼脂糖凝胶电泳示图，其中M为DNA标准分子量； 1为PCR扩增产物；
[0027] 图2是不同IPTG浓度对蛋白表达影响的SDS-PAGE示图，其中M为蛋白质标准 分子量；1为未加 IPTG诱导的菌体总蛋白；2为0. 5mmol/L IPTG诱导后的菌体总蛋白；3 为0. 75mmol/L IPTG诱导后的菌体总蛋白；4为lmmol/L IPTG诱导后的菌体总蛋白；5为 2mmol/L IPTG诱导后的菌体总蛋白；6为3mmol/L IPTG诱导后的菌体总蛋白。箭头所指为 目的蛋白位置；
[0028] 图3是不同诱导时间对蛋白表达影响的SDS-PAGE示图，其中M为蛋白质标准分子 量；1为诱导〇小时的菌体总蛋白；2为诱导1小时的菌体总蛋白；3为诱导2小时的菌体总 蛋白；4为诱导3小时的菌体总蛋白；5为诱导4小时的菌体总蛋白；6为诱导5小时的菌体 总蛋白；7为诱导6小时的菌体总蛋白；8为诱导7小时的菌体总蛋白；9为诱导8小时的菌 体总蛋白。箭头所指为目的蛋白位置；
[0029] 图4是鉴定获得的目的蛋白表达形式的SDS-PAGE示图，其中M为蛋白质标准分子 量；1为IPTG诱导前的菌体总蛋白；2为IPTG诱导后的菌体总蛋白；3为超声破碎后沉淀； 4为超声破碎后上清；箭头所指为目的蛋白位置；
[0030] 图5是纯化后目的蛋白的SDS-PAGE示图，其中M为蛋白质标准分子量，1为纯化 后的重组蛋白，2为IPTG诱导后的菌体总蛋白；3为IPTG诱导前的菌体总蛋白；
[0031] 图6是用anti-His(C-term)单克隆抗体鉴定纯化后的重组蛋白的Western blot 示图；
[0032] 图7是用ELISA法评定抗体效价示图；
[0033] 图8是制备的抗体与重组Sixl蛋白的Western blot示图。
【具体实施方式】
[0034] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0035] 实施例1 :大肠杆菌表达载体pET30a(+)-pSixl的构建与鉴定
[0036] 取正常猪的背最长肌，TRIzoI试剂盒提取猪背最长肌总RNA，用反转录试剂盒 反转录得到总cDNA，以此为模板进行PCR扩增，PCR反应体系（总反应体系50 μ 1)为： (ΜΗ2020 μ1，上下游引物（ΙΟμ--)各 Ιμ?，cDNA3yl，2XTaq PCR master Π?χ25μ1。PCR 反应条件为：95°C预变性3min，然后进行95°C 30s，60°C 30s，72°C lmin，共35个循环，最后 再72°C延伸lOmin。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。由图1可见，在750? IOOObp间有一清晰的亮带，与预期大小吻合。
[0037] PCR产物采用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I核酸胶回收试剂盒回收PCR产 物，具体方法参考试剂盒说明书。回收后的PCR产物用NdeI和XhoI双酶切后通过T4DNA 连接酶连接到经同样双酶切的pET30a(+)表达载体中，16°C水浴条件下反应6小时，构建 pET30a(+)-pSixl重组表达载体。将重组表达载体转化到大肠杆菌菌株DH5a中，在LB固 体平板（含50 μ g/ml卡那霉素）上于37°C培养筛选重组子，经菌落PCR和酶切鉴定正确 后，再通过DNA测序验证其序列正确性。测序结果表明，所获得的猪Sixl基因编码区序列 与GenBank上已知的序列100%同源。成功构建的重组质粒命名为pET30a(+)-pSixl。
[0038] 猪Sixl基因编码区（不含终止密码子）序列与pET30a(+)连接克隆测序结果如 下：
[0039] ATGTCGATGCTGCCATCGTTCGGCTTCACACAGGAGCAAGTGGCTTGCGTGTGCGAGGTTCTGCAACAA GGTGGGAACCTGGAGCGCCTGGGCAGGTTCCTGTGGTCGCTGCCAGCCTGCGACCACCTGCACAAGAACGAAAGTGT GCTCAAGGCCAAGGCGGTGGTCGCCTTCCACCGCGGCAACTTCCGCGAGCTTTACAAGATCCTGGAGAGCCACCAGT TCTCGCCTCACAACCACCCCAAGCTGCAACAACTGTGGCTGAAGGCGCACTACGTGGAGGCTGAGAAGTTGCGCGGT CGGCCCCTGGGCGCGGTGGGCAAATATCGGGTGCGCCGAAAATTCCCGTTGCCGCGCACTATCTGGGACGGCGAAGA GACCAGCTACTGCTTCAAGGAGAAGTCGCGGGGCGTGTTGCGGGAGTGGTACGCCCATAACCCCTACCCCTCGCCGC GTGAGAAGCGGGAGCTGGCCGAGGCCACCGGCCTCACCACCACCCAGGTCAGCAACTGGTTCAAGAACCGAAGGCAA CGAGACCGGGCCGCCGAGGCCAAGGAAAGGGAGAACACCGAAAACAATAACTCCTCCTCCAACAAGCAGAATCAACT CTCTCCTCTGGAAGGGGGAAAGCCGCTCATGTCCAGCTCAGAAGAAGAATTCTCACCTCCCCAAAGTCCAGACCAGA ACTCGGTCCTTCTGCTGCAGGGCAATATGGGCCACGCCAGGAGCTCAAACTATTCCCTCCCGGGTTTAACGGCCTCG CAGCCCACCCACGGCCTGCAAGCCCACCAGCATCAGCTCCAGGACTCCCTGCTGGGCCCCCTCACCTCCAGTCTGGT GGACTTAGGGTCC
[0040] 其氨基酸序列如下：
[0041] MSMLPSFGFTQEQVACVCEVLQQGGNLERLGRFLWSLPACDHLHKNESVLKAKAWAFHRGNFRELYKI LESHQFSPHNHPKLQQLWLKAHYVEAEKLRGRPLGAVGKYRVRRKFPLPRTIWDGEETSYCFKEKSRGVLREWYAHN PYPSPREKRELAEATGLTTTQVSNWFKNRRQRDRAAEAKERENTENNNSSSNKQNQLSPLEGGKPLMSSSEEEFSPP QSPDQNSVLLLQGNMGHARSSNYSLPGLTASQPTHGLQAHQHQLQDSLLGPLTSSLVDLGS
[0042] 实施例2 :猪Sixl在大肠杆菌中的表达
[0043] 1、获得表达猪Sixl的基因工程菌：挑测序成功的菌接种到4ml含有卡那霉素 (50 μ g/ml)的LB液体培养基中，37°C、250rpm振荡培养过夜，按照OMEGA公司的E. Z. N. A 质粒小量提取试剂盒将pET30a(+)-pSixl重组表达载体提取出来并转化到大肠杆菌菌株 BL21(DE3)感受态细胞中，在LB琼脂平板（含50μg/ml卡那霉素）上于37°C培养筛选重 组子，获得的重组子为表达猪Sixl的基因工程菌。随机选取1个单菌落进行划线培养， 12h后取少量长出的划线培养菌接种于4mlLB液体培养基（含50 μ g/ml卡那霉素），37°C、 250rpm振荡培养过夜，然后按850 μ 1菌液加入150 μ 1灭菌甘油，混匀后即为甘油保存菌， 贮存于_80°C冰箱。
[0044] 2、猪Sixl重组蛋白的表达
[0045] 2. IIPTG浓度对猪Sixl蛋白质表达的影响
[0046] 将步骤1保存的猪Sixl基因工程菌按照1:500接种到4ml LB液体培养基中， 37°C、250rpm振荡培养过夜，活化菌种。将活化的工程菌按1%分别接种于15ml LB液体培 养基（含卡那霉素50 μ g/ml)中，37°C、250rpm振荡培养至OD6tltl为0· 4?0· 6时加入IPTG， 使其终浓度分别为 0iffln〇l/L、0· 5mmol/L、0. 75mmol/L、l. 0mmol/L、2. 0mmol/L、3. Ommol/L, 30°C诱导培养2小时后各取Iml菌液离心取沉淀，，用50 μ 11 X蛋白上样缓冲液重悬菌体， 在KKTC加热5分钟以使蛋白质变性，置于冰中冷却，然后取5μ 1进行SDS-PAGE电泳和考 马斯亮蓝染色，脱色后将SDS-PAGE电泳结果扫描，经凝胶成像系统分析，确定目的蛋白占 总蛋白的比例。
[0047] 实验结果表明（图 2), IPTG 在 0· 5mmol/L、0. 75mmol/L、I. 0mmol/L、2. Ommo I/ L、3. Ommol/L终浓度下，目的蛋白占总蛋白的比例分别为15. 04%、15. 89%、15. 41%、 19. 73%、17. 37%。说明在IPTG浓度为2. Ommol/L时，目的蛋白占总蛋白比例最大，因此确 立2. Ommol/L为诱导的最佳IPTG浓度。
[0048] 2. 2诱导时间对猪Sixl蛋白质表达的影响
[0049] 将活化的工程菌接种于15mlLB液体培养基（含卡那霉素50 μ g/ml)，37°C，250rpm 振荡培养至OD6c?为0. 4?0. 6时加入IPTG，使其终浓度为分2. Ommol/L，30°C下分别在诱 导培养的〇小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时取Iml菌液， 离心取沉淀，用50 μ IlX蛋白上样缓冲液重悬菌体，在KKTC加热5分钟以使蛋白质变性， 置于冰中冷却，然后取5μ 1进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，脱色后将SDS-PAGE电 泳结果扫描，经凝胶成像系统分析，确定目的蛋白占总蛋白的比例。
[0050] 实验结果表明（图3)，诱导时间0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、 6小时、7小时、8小时的条件下，目的蛋白占总蛋白的比例分别为0、17. 19 %、19. 04%、 14·71%、12· 14%、10.87%、10.57%、10.03%、9.34%。说明诱导时间为 2 小时左右，目的 蛋白占总蛋白比例最商，因此确立2小时为最佳诱导时间。
[0051] 实施例3 :重组猪Sixl蛋白的表达形式检测、分离纯化及鉴定
[0052] 1、重组猪Sixl蛋白的表达形式检测
[0053] 将活化的工程菌接种于50mlLB液体培养基（含卡那霉素50 μ g/ml)，37°C，250rpm 振荡培养至〇D_为0. 4?0. 6时加入IPTG，根据对诱导条件的摸索结果（如图2、图3)，使 其终浓度为分2. 0mmol/L，3(TC诱导2小时后离心取沉淀，用6mL0. 01mol/LPBS(pH7. 4)重 悬菌体后超声破碎：功率为260W，超声2秒，间隔5秒，作用30分钟后至溶液澄清，1200rpm 离心30分钟，分别保留上清和沉淀（包涵体）后进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色、 脱色后经凝胶成像系统分析。
[0054] 实验结果表明（图4)，Sixl主要以包涵体的形式表达。
[0055] 2、重组猪Sixl蛋白的分离纯化及鉴定
[0056] 经检测猪Sixl重组蛋白表达形式后发现Sixl重组蛋白的表达主要以包涵体形式 存在，所以重组猪Sixl蛋白质的分离纯化参照上海生物工程技术有限公司的Ni-IDA琼脂 糖亲和层析柱中的变性条件下（Ni-Denature-GuHCl法）的方法纯化。
[0057] 将活化的工程菌接种于50ml LB液体培养基（含卡那霉素50μ g/ml)，37°C， 250rpm振荡培养至OD6tltl为0. 4?0. 6时加入IPTG，使其终浓度为分2. 0mmol/L，30°C诱导 2小时后6000rpm离心10分钟取沉淀，向沉淀中加入3ml的盐酸胍裂解液（IOOmM磷酸二氢 钠，300mM氯化钠，6M盐酸胍，pH8. 0)裂解Ih至溶液澄清；12000rpm离心20分钟，收集上清， 上清经0. 45 μ m滤膜过滤。10倍柱体积的Ni-Denature-urea(100mM磷酸二氢钠，300mM氯 化钠，8M尿素，pH8.0)缓冲液平衡柱子，流速为lml/min ;经滤膜过滤后的Im上清样经过纯 化柱，流速0. 5-lml/min ;10倍柱体积的Ni-Denature-urea缓冲液冲洗柱子，流速为Iml/ min ;5 倍柱体积的 Ni-Denature-250 (IOOmM 磷酸二氢钠，300mM 氯化钠，250mM 咪唑，PH8. 0) 缓冲液收集洗脱液得纯化蛋白，流速为lml/min，收集洗脱缓冲液得纯化的重组猪Sixl蛋 白，-80°C保存，并取样进行SDS-PAGE电泳纯度分析和Western Blot鉴定。
[0058] 实验结果表明，纯化后的重组猪Sixl蛋白为单一的一条带，其纯度大于90% (图 5);经anti-His(C-term)单克隆抗体（美国Invitrogen公司产品）Western blot鉴定其 为猪Sixl蛋白（图6)。
[0059] 实施例4 :猪Sixl蛋白的多克隆抗体的制备及抗体效价和特异性评定
[0060] 经实施例3步骤后，证实了纯化的蛋白质为重组猪Sixl蛋白后，参照BCA蛋白浓 度测定试剂盒说明，测定纯化后重组猪Sixl蛋白的蛋白浓度。将纯化后的重组猪Sixl蛋 白作为抗原免疫大鼠，免疫前断尾采血2ml，收集血清作为阴性血清，第一次免疫用300 μ g 纯化的重组猪Sixl蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫大鼠，2周后用200 μ g纯化的 重组猪Sixl蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后免疫大鼠，每隔10天再2次加强免疫， 总共4次免疫，最后一次加免7天后，采血，收集抗血清；阴性血清作为阴性对照，ELISA法 测定抗体效价，Western blot测定抗体特异性。
[0061] 抗体效价定义为稀释后的抗血清在490nm吸光度大于免疫前（阴性对照）血清 2. 1倍时的最高稀释倍数。实验结果表明，经ELISA法测定制备的多克隆抗体抗血清效价大 于1:40960 (图7);经Western blot分析抗体特异性得出抗体特异性良好（图8)。
[0062] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种猪Sixl蛋白的体外表达方法，其特征是：包括下列步骤： (1) 提取猪背最长肌总RNA ; (2) 构建用于表达猪Sixl蛋白的大肠杆菌重组表达载体； (3) 将重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，构建携带重组表达载体的 基因工程菌； (4) 培养基因工程菌至0D6(?达到0. 4?0. 6,加入诱导剂IPTG，诱导猪Sixl基因在该 基因工程菌中表达； (5) 纯化表达系统表达的重组猪Sixl ; (6) 重组猪Sixl蛋白表达形式的鉴定。
2. 如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（2)中，构建载体时，克隆猪Sixl基因的 插入位点为Nde I和Xho I酶切位点。
3. 如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（2)中，构建载体时，所用的引物序列如下 所示： 上游：5, -CCCAATTCCATATGTCGATGCTGCCATCGTTCGGCTTC-3' 下游：5' -AAACTCGAGGGACCCTAAGTCCACCAGACTGGAG-3' ； PCR反应条件为：95°C预变性3min，然后95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin， 共进行35个循环，最后72°C延伸lOmin。
4. 如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤⑷中，诱导剂IPTG浓度为2mmol/L，诱 导时间为2小时。
5. 如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（5)中，所述纯化是用镍柱亲和层析法中 的变性条件方法进行纯化。
6. 如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（6)中，所述重组猪Sixl蛋白表达形式的 鉴定为超生破碎法，其中超声破碎功率为260W，超声破碎2秒，间隔5秒，作用30分钟，并经 SDS-PAGE电泳分析。
7. 如权利要求1?6任一项所述方法所得的猪Sixl蛋白，其特征在于，所述重组猪 Sixl蛋白C端带有6个组氨酸标签。
8. -种猪Sixl多克隆抗体的制备方法，其特征是：挑取构建含有携带重组表达载体的 基因工程菌，接种到4ml含有浓度为50 μ g/ml的卡那霉素的液体LB液体培养基中，37°C、 250rpm振荡培养过夜活化，将活化的基因工程菌按1 %接种于50ml含有浓度为50 μ g/ml 的卡那霉素的LB液体培养基，37°C、250rpm振荡培养至0D_为0. 4-0. 6时加入IPTG，使其 终浓度为2. 0mm〇l/L，3(TC诱导2小时，菌液离心，收集菌体，经裂解、纯化后收集蛋白，将纯 化后重组猪Sixl蛋白作为抗原免疫Sprague-Dawley大鼠，免疫前断尾采血2ml，收集血清 作为阴性血清，300 μ g重组猪Sixl蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫大鼠，2周后 用200 μ g重组猪Sixl蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后免疫大鼠，每隔10天再次加 强免疫，共4次免疫，最后一次免疫7天后采血，收集抗血清。
【文档编号】C07K16/18GK104263746SQ201410457862
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月10日 优先权日:2014年9月10日
【发明者】黄志清, 陈小玲, 徐孟, 陈代文, 余冰 申请人:四川农业大学