米诺地尔人工抗原、其多克隆抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种米诺地尔人工抗原、其多克隆抗体及其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 米诺地尔是一种治疗高血压的血管扩张药，局部长期使用时可刺激毛发增生。 1988年美国FDA批准米诺地尔可外用治疗男性雄激素性脱发。虽然米诺地尔只是局部外 用，但存在头皮轻度皮炎、眩晕、刺激性过敏、面部和四肢多毛症等不良反应，使用不慎 可能会灼伤和刺激眼部。日用洗发护发类化妆品不允许添加该药物，《化妆品卫生规范》 (2007)明令禁止在化妆品中添加米诺地尔。但一些生产商为使洗发护发类化妆品达到一定 功效，牟取利润，违规添加米诺地尔。因此，有必要对洗发护发类化妆品中是否含有米诺地 尔及其盐和衍生物进彳丁检测。
[0003] 近年来，食品中农药、兽药残留、保健品和化妆品中的非法添加剂的检测方法已成 为研宄热点，其中，以小分子为待测物的免疫分析技术发展迅速。免疫分析是以抗原与抗体 的特异性结合反应为基础的新型分析技术。相对于传统检测方法，它具有简便、快速、灵敏 度高和成本低廉、便于现场检测和高度特异性等特点。此外，免疫分析技术对药品鉴定、药 物代谢研宄、药材中农药和重金属残留的检验、解毒及环境监测等也具有重要意义。
[0004] 免疫分析几乎适用于所有生物活性物质的检测，其基本原理是以待测物合成人工 抗原，经动物获取相应的单克隆抗体，然后建立和优化免疫分析程序进行检测。有效的人工 抗原的合成是保证免疫分析的前提和关键，其合成途径一般为：先根据待测分子的结构设 计合成具有活性基团的半抗原，然后依据免疫学原理选择适当的载体，最后用适当的方式 将半抗原与载体相互耦联，形成载体-半抗原结合物，纯化后即得到人工抗原。
[0005] 最近几年，对于人工抗原的合成国内外已有较多报道，Tuomola等用一个分子量很 小的化合物（分子量为131. 2) 3-甲基吲哚的羰基与适当较长的连接臂连接，合成9个半 抗原，通过进一步筛选实验得到特异性单克隆抗体。
[0006] 虽然人工抗原的合成方法有了很大的发展，但是所得到人工抗原的免疫原性差异 较大，部分人工抗原不能完全满足免疫分析的要求。由于免疫应答具有其复杂性，对于一个 具体的待测物，其人工抗原的合成要根据自身结构特征具体分析与对待，需要设计、组合出 多套方案，如从不同位置引入不同性质的基团、不同长度的间隔臂，将半抗原与多种载体相 结合，通过改变投料比例获得不同结合比的人工抗原等等。通过免疫活性测试，优化筛选制 备方案。因此，人工抗原合成研宄不单纯是化学合成问题，亦涉及免疫学原理，如何根据免 疫学原理合成具有较高免疫原性的人工抗原是该领域的重要研宄方向。
[0007] 目前国内仍未有明确关于洗发护发类化妆品中米诺地尔及其盐和衍生物的检测 方法标准。有文献报道用紫外分光光度计和高效液相色谱法测定米诺地尔洗剂和血浆中的 米诺地尔，但这两种方法灵敏度差、不具有特异性。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有良好免疫原性的米诺地尔 人工抗原、其多克隆抗体及其制备方法和应用。解决当前没有高灵敏度、高特异性的米诺地 尔及其盐和衍生物的检测方法的问题。
[0009] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0010] 一种米诺地尔人工抗原，其结构式为：
[0011]
【主权项】
1. 一种米诺地尔人工抗原，其特征在于，其结构式为：
〇
2. 根据权利要求1所述的一种米诺地尔人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下 步骤： (1)取米诺地尔（Minoxidil)，溶于甲醇中，再加水稀释，即得溶液I ; ⑵取蛋白载体，溶于PH值为7. 2-7. 4的缓冲溶液中，即得溶液II ; (3) 取25%的戊二醛（GA)，加水稀释40?50倍，即得溶液III ; (4) 量取溶液I、溶液II、溶液III，其中溶液I和溶液III的摩尔浓度比为50?100:1，将 溶液I和溶液III混合均匀，混合后溶液逐滴加入到溶液II中，溶液I和溶液III的混合液与 溶液II的体积比为1?2:5,搅拌8-12小时； (5) 将步骤（4)所得混合溶液装入透析袋中，对水透析4-5天，每天更换2-3次透析液， 收集透析外液，即得米诺地尔人工抗原。
3. 根据权利要求2所述的一种米诺地尔人工抗原的制备方法，其特征在于，所述蛋白 载体为牛血清白蛋白（BSA)。
4. 根据权利要求2所述的一种米诺地尔人工抗原的制备方法，其特征在于，所述溶液 I和溶液III的摩尔浓度比为80:1。
5. 根据权利要求1所述的一种米诺地尔人工抗原的多克隆抗体，其特征在于，所述米 诺地尔人工抗原的多克隆抗体是能与所述米诺地尔人工抗原发生特异性免疫反应的免疫 球蛋白。
6. 根据权利要求5所述的一种米诺地尔人工抗原多克隆抗体的制备方法，其特征在 于，包括如下步骤： (1) 将制备好的米诺地尔人工抗原作为免疫原，对小鼠进行注射； (2) 第一次免疫注射后，每隔2周注射一次，S卩加强免疫； (3) 从第二次加强免疫起，每次加强免疫后的第7-10天，剪尾釆血，免疫注射4-6次； (4) 从采集的血液中分离获得抗血清。
7. 根据权利要求5所述的一种米诺地尔人工抗原多克隆抗体的应用，其特征在于，所 述多克隆抗体用于米诺地尔及其盐和衍生物的免疫检测。
【专利摘要】本发明提供一种具有良好免疫原性的米诺地尔人工抗原、其多克隆抗体及其制备方法和应用。通过米诺地尔半抗原设计、连接臂引入、载体引入、合成、纯化等步骤制备出具有免疫原性的人工抗原，再经免疫动物等步骤制备出多克隆抗体并评估其效价。本发明提供的米诺地尔人工抗原及其多克隆抗体可用于米诺地尔的免疫检测，满足低成本、快捷、操作简便的检测要求；解决当前没有高灵敏度、高特异性的米诺地尔及其盐和衍生物的检测方法的问题。
【IPC分类】C07K16-18, G01N33-53, C07K14-765
【公开号】CN104530220
【申请号】CN201410742420
【发明人】张癸荣, 魏彪
【申请人】中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月5日