专利名称：甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物抗病性鉴定领域，具体是一种甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备。
背景技术：
甘鹿黑穗病是由黑粉菌(Ustilago scitaminea syd)引起的一种真菌性病害，自1877年在南非的纳塔尔地区首次被发现至今在全国的各个植蔗区均有此病发生的报道。此病是一种气传性病害，能够导致蔗茎产量和蔗糖分的严重损失，随着宿根年限的增加发病越来越严重，发病严重的品种和地块发病率达到60%，因此病而淘汰了一批丰产高糖的甘蔗优良品种。防治此病最有效最经济的方法是培育优良的甘蔗新品种，而抗病性的鉴定是抗病育种的基础和关键，鉴定的准确性和效率直接影响到抗病育种的进程和效果。
目前，国内外还主要是通过鉴别寄主法对甘蔗进行抗黑穗病性鉴定，此法周期长，工作量大，耗资高，通常由实生苗育成新甘蔗品种的概率为1/100000，因此此法与甘蔗育种的大群体要求不相适用。随着免疫学技术的发展成熟及其在动植物病原菌检测上的成功应用，使得应用此方法检测甘蔗黑穗病成为可能。该方法具有操作简单，可同时检测多个样品等优点，符合甘蔗育种过程中大群体筛选的需求。但是，目前还未见有甘蔗黑穗病抗体制备的报道。因此，制备甘蔗黑穗病病原菌抗体并结合针刺接种技术，可在甘蔗实生苗期进行批量的筛选，提高筛选效率，缩短甘蔗抗黑穗病育种年限。
发明内容
本发明的目的为了克服已有对甘蔗进行抗黑穗病性鉴定的鉴别寄主法的周期长，工作量大，耗资高，提供一种具有纯度高，特异性好，效价高，保存长久，对甘蔗通过免疫学方法检测甘蔗黑穗病和人工接种提高甘蔗抗黑穗病育种效率的甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备。本发明通过下述的技术方案来实现一种甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备，其特征在于采集甘蔗大田的甘蔗黑穗病病原菌，制备抗原，将抗原在PDA培养基上培养获得到多克隆抗体，主要包括以下步骤(I)抗原采集和制备在甘蔗大田采集黑穗病病原菌，制备抗原(真菌孢子，菌丝体胞外多糖或上清液)备用；(2)抗原免疫培养将获得的抗原与等量的福氏完全佐剂混合，乳化，在颈背部皮下多点注射，免疫新西兰白兔；第15天，取Iml抗原加入等量福氏不完全佐剂，乳化，在颈背部皮下多点注射，免疫新西兰白兔；每隔2周，按照所述的剂量和方法多次免疫白兔，在第八周测定效价达到要求后，颈动脉取血备用；(3)分离纯化将步骤(2)获得的抗血清进行分离纯化，获得甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体。
以上所述的抗原采集和制备，主要步骤是(I)从甘蔗大田中采集黑穗病鞭子，将白色薄膜去除后，将黑穗病真菌孢子粉收集到牛皮纸袋中，然后于45°c中烘干lh，用保鲜袋包好存于4°C冰箱中备用；(2)将真菌孢子用无菌水按50-100个孢子/ml稀释，涂布于含有50ng/ml链霉素的PDA固体培养基上，于28°C恒温培养箱中培养3天，获取单菌落后，挑取少许菌丝体到含有50ng/ml链霉素的PDA液体培养基中，于28°C恒温培养箱中培养2天；(3)上清液抗原的制备量取适量步骤(2)的培养液，于冷冻离心机中4°C，4000r/min,5min离心，取上层清液作为抗原，放入_20°C冰箱中保存，备用；(4)菌丝体胞外多糖抗原的制备量取适量步骤(2)的培养液，于冷冻离心机中40C，4000r/min, 5min离心，吸取上清液，加入2倍体积的95%的乙醇，用灭菌的玻璃棒搅起丝状沉淀物，再于冷冻离心机中4°C，4000r/min，IOmin离心，倒掉上清液后，用85%的乙醇 洗涤沉淀两次，此沉淀物即为胞外多糖，室温干燥乙醇挥发完全后，加入5ml的PBS后即为胞外多糖抗原，放入_20°C冰箱中保存，备用。以上所述的抗原免疫培养和分离纯化，主要步骤是(I)用PBS将真菌孢子稀释为2*108个/ml，分装后冻存于_20°C冰箱；(2)第I天，取Iml抗原加入Iml福氏完全佐剂，乳化，将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中检验，不散开表明已达到要求；在颈背部皮下多点注射，免疫两只新西兰白兔；(3)两周后，取Iml抗原加入Iml福氏不完全佐剂，乳化，将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中检验，不散开表明已达到要求；在颈背部皮下多点注射，免疫两只新西兰白兔；(4)每隔2周，按照步骤(3)所述的方法检验；( 5 )测定效价合格后，颈动脉取血；(6)兔血在4°C放置过夜，于4°C，10000rpmr/min冷冻离心机中离心30min，收集上清液。以上所述的多点注射是在颈背部皮下注射8-10点。以上所述的多克隆抗体应用于甘蔗抗黑穗病品种的育种。发明的优点及其积极效果本发明首次提出了甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备，其优点在于特异性高，效价高，保存长久。应用此多克隆抗体结合针刺接种技术对甘蔗实生苗进行黑穗病抗性检测较传统的鉴别寄主法具有省时省力，节约物资，操作简单及不受过多的外界环境干扰等优点。对甘蔗科研中通过免疫学方法检测甘蔗黑穗病具有重要意义，结合人工接种技术能提高甘蔗抗黑穗病育种效率，可在甘蔗五圃制选育程序的前期阶段淘汰感病品系，提高抗黑穗病品系在所选育的甘蔗优良品系中的比例，因此可用于甘蔗抗黑穗病品种的选育。
具体实施例方式通过下面的实施例对本发明做进一步的详细说明。实施例一I、黑穗病病原菌的获得和孢子抗原制备在黑穗病高发的7-8月份，从甘蔗大田中采集黑穗病鞭子，将白色薄膜去除后，将黑穗病孢子粉收集到牛皮纸袋中，然后于45°C中烘干lh，用保鲜袋包好存于4°C冰箱中。将孢子用无菌水稀释后(约50-100个孢子/ml)涂布于含有50ng/ml链霉素的PDA固体培养基上于28°C恒温培养箱中培养3天，获取单菌落，将单菌落继续培养获取孢子粉，收集后于45°C烘干lh，用保鲜袋包好存于4°C冰箱中，此即黑穗病孢子抗原。2、多克隆抗体制备的免疫流程用PBS将真菌孢子稀释为2*108个/ml，分装后冻存于_20°C冰箱。第I天，取Iml抗原加入Iml福氏完全佐剂(Sigma公司，货号F5881),乳化(检验乳化程度将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中，若不散开，表明已达到要求)，在颈背部皮下多点(8-10点)注射，免疫两只新西兰白兔。第15天,取Iml抗原加入Iml福氏不完全佐剂(Sigma公司，货号F5506),乳化(检验乳化程度将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中，若不散开，表明已达到要求)，在颈背部皮下多点(8-10点)注射，免疫两只新西兰白兔。第29天，取Iml抗原加入Iml福氏不完全佐剂(Sigma公司，货号F5506)，乳化(检验乳化程度将一滴乳化抗原液滴入生理 盐水中，若不散开，表明已达到要求)，在颈背部皮下多点(8-10点)注射，免疫两只新西兰白兔。第43天,取取Iml抗原加入Iml福氏不完全佐剂(Sigma公司，货号F5506),乳化(检验乳化程度将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中，若不散开，表明已达到要求)，在颈背部皮下多点(8-10点)注射，免疫两只新西兰白兔。第53天，测定效价合格后颈动脉取血。兔血在4°C放置过夜，于冷冻离心机中离心(4°C，10000r/min)30min，收集上清液，此即所获得的以甘蔗黑穗病病原菌孢子为抗原的多克隆抗体。最终获得多克隆抗体的量新西兰白兔I为48ml ;新西兰白兔2为45. 5ml。3、所获得多克隆抗体免疫效果的Elisa检查(I)孢子处理降黑穗病孢子用PBS (Ιχ,ρΗ 7. 2)缓冲液重悬，然后用超声波仪进行超声裂解。(2)包被超声裂解的孢子用包被液(CBS, IX)稀释成1*108个/ml，100 μ I/孔加至酶标板，于4°C冰箱中过夜。(注抗原包被液配制称取Na2CO3 I. 59g, NaHCO3 2. 93g，灭菌的去离子水950ml，调节pH值至9. 6，加去离子水定容至1000ml，4°C保存)。(3)第二天用吹风机吹干后，每孔加入5%的戊二醛溶液lOOul，在室温下固定60mino(4)封闭将固定液弃去，每孔加入200μ I封闭液(5g脱脂奶粉，溶解于100ml PBS中，混匀后于4°C中保存备用，不宜超过3天)，37°C恒温培养箱中放置1.5h。(5)加入样本弃去封闭液，将所获得的多克隆抗体分别稀释1250倍，2500倍，5000倍，10000倍，20000倍，40000倍和80000倍，以每个样品100 μ I的量加入酶标板中，37 °C恒温培养箱中放置Ih。(6)洗涤用自来水冲洗10次，在吸水纸上拍干。(7)加入二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔用封闭液稀释至工作浓度，每孔100 μ I加入酶标板，37°C恒温培养箱中放置30min。(8)洗涤用ddH20冲洗10次，在吸水纸上拍干。(9)加入TMB显示底物每孔100 μ I加入酶标板,37°C恒温培养箱中放置15min。TMB显色液的配置为①TMB储存液称取TMB粉末，用DMSO配成I. 5mg/ml的储存液，_20°C分装保存；
②NaAc缓冲液配制200mM的NaAc溶液，用HAc调节pH值至5. 3 ；③H2O2溶液配制O. 03%的H2O2溶液；④使用时按照TMB储存液=NaAc缓冲液=H2O2溶液=1:4:5的比例配制显色液，现配现用。(10)加入终止液每孔加入2M的H2SO4溶液50 μ I。(11)读数在酶标仪上于450nm波长处测得其OD值。表I甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的Elisa检测结果
权利要求
1.一种甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备，其特征在于采集甘蔗大田的甘蔗黑穗病病原菌，制备抗原，将抗原在PDA培养基上培养获得到多克隆抗体，主要包括以下步骤 (1)抗原采集和制备在甘蔗大田采集黑穗病病原菌，制备抗原(真菌孢子，菌丝体胞外多糖或上清液)备用； (2)抗原免疫培养将获得的抗原与等量的福氏完全佐剂混合，乳化，在颈背部皮下多点注射，免疫新西兰白兔；第15天，取I ml抗原加入等量福氏不完全佐剂，乳化，在颈背部皮下多点(8-10点)注射，免疫新西兰白兔；每隔2周，按照所述的剂量和方法多次免疫白兔，在第八周测定效价达到要求后，颈动脉取血备用； (2)分离纯化将步骤(2)获得的抗血清进行分离纯化，获得目标多克隆抗体。
2.如权利要求I所述的甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备，其特征在于所述的抗原采集和制备，主要步骤是 (1)从甘蔗大田中采集黑穗病鞭子，将白色薄膜去除后，将黑穗病真菌孢子粉收集到牛皮纸袋中，然后于45°C中烘干I h，用保鲜袋包好存于4°C冰箱中备用； (2)将真菌孢子用无菌水按50-100个孢子/ml稀释，涂布于含有50ng/ml链霉素的PDA固体培养基上，于28°C恒温培养箱中培养3天，获取单菌落后，挑取少许菌丝体到含有50 ng/ml链霉素的PDA液体培养基中，于28°C恒温培养箱中培养2天； (3)上清液抗原的制备量取适量步骤(2)的培养液，于冷冻离心机中4°C，4000r/min，5 min离心，取上层清液作为抗原，放入-20°C冰箱中保存，备用； (4)菌丝体胞外多糖抗原的制备量取适量步骤(2)的培养液，于冷冻离心机中4°C，4000 r/min，5 min离心，吸取上清液，加入2倍体积的95 %的乙醇，用灭菌的玻璃棒搅起丝状沉淀物，再于冷冻离心机中4°C，4000 r/min, 10 min离心，倒掉上清液后，用85%的乙醇洗涤沉淀两次，此沉淀物即为胞外多糖，室温干燥乙醇挥发完全后，加入5 ml的PBS后即为胞外多糖抗原，放入_20°C冰箱中保存，备用。
3.如权利要求I所述的甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备，其特征在于所述的抗原免疫培养和分离纯化，主要步骤是 (1)用PBS将真菌孢子稀释为2*108个/ml，分装后冻存于_20°C冰箱； (2)第I天，取Iml抗原加入I ml福氏完全佐剂，乳化，将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中检验，不散开表明已达到要求；在颈背部皮下多点(8-10点)注射，免疫两只新西兰白兔； (3)两周后,取Iml抗原加入I ml福氏不完全佐剂,乳化,将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中检验，不散开表明已达到要求；在颈背部皮下多点(8-10点)注射，免疫两只新西兰白兔； (4)每隔2周，按照步骤(3)所述的方法检验； (5)测定效价合格后，颈动脉取血； (6)兔血在4°C放置过夜，于4°C，10000r/min冷冻离心机中离心30 min，收集上清液。
全文摘要
本发明公开了甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备，本发明采用的抗原为从甘蔗大田采集的成熟黑穗病病原菌孢子，经处理后在PDA培养基上培养获得，其步骤包括(1)黑穗病病原菌孢子的采集处理，制备抗原；(2)取等量抗原(真菌孢子、菌丝体胞外多糖或上清液)分别与福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂混合，乳化，颈背部皮下多点注射免疫新西兰白兔；(3)每两个星期免疫一次，共免疫四次，第八个星期后，颈动脉采血；(4)分离抗血清并纯化，获得目标多克隆抗体。本发明制备的多克隆抗体具有纯度高，特异性好，效价高，保存长久等优点，对甘蔗科研中通过免疫学方法检测甘蔗黑穗病具有重要意义，结合人工接种技术能提高甘蔗抗黑穗病育种效率。
文档编号C07K16/14GK102911269SQ20121047439
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者杨丽涛, 宋修鹏, 李杨瑞 申请人:广西大学