一种eola1多克隆抗体的制备及免疫定位方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种E OLA I多克隆抗体的制备及免疫定位方法，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002]人内皮高表达脂多糖相关因子l(endothel ial-overexpressedlipopolysaccharide-associatedfact
or I，E0LA I)基因是本研究室前期克隆到的一个人类新基因，因其受到脂多糖(LP S )刺激后在内皮细胞中表达上调，故命名为内皮细胞高表达脂多糖相关因子I (EOLA I )，前期对E OLAl基因的定位进行了研究，因其所编码的蛋白结构存在蛋白激酶C和酪氨酸激酶一磷酸化位点及一个螺旋一转角一螺旋(H T H)基序，考虑其可能为细胞转录因子，参与细胞内的信号转导，研究基因功能的一个重要前提就是需要用合适的抗体去检测基因的表达，然现有技术中还未有该抗体去检测基因表达。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是:提供一种E OLAl多克隆抗体的制备及免疫定位方法，该方法能成功制备E O LA I多克隆抗体，证实E O LA I蛋白在乳腺癌组织癌细胞胞浆中有表达，以克服现有技术的不足。
[0004]本发明的技术方案
一种E O L A I多克隆抗体的制备及免疫定位方法，该方法采用构建重组质粒，转化大肠杆菌及诱导表达，抽提目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，免疫组织化学法检测E OLA I在部分人体恶性肿瘤组织中的表达。
[0005]由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明采用原核表达的方法制备了EOLAl蛋白全长序列抗原，以此免疫家兔后获得了高效价的兔抗人E OLAl多克隆抗体，用免疫组织化学法检测了肿瘤组织中E O L A I的表达情况，结果显示E OLAl蛋白在检测的食道癌、胃癌、肝癌、结肠癌、肺癌、脑胶质瘤和乳腺癌间质细胞胞浆中都有表达，而在实质癌细胞中仅有乳腺癌细胞胞浆可见表达，肿瘤间质由纤维结缔组织及血管组成，各种肿瘤的间质基本相同，不具特异性，对肿瘤实质起营养和支持保护作用，EOLAI蛋白大量表达于肿瘤间质细胞，提示E O L A I蛋白在肿瘤血管生成和转移方面发挥重要作用，血管生成除在肿瘤发生发展中具有重要地位外，也参与了糖尿病眼底视网膜病变、缺血再灌注损伤等病理生理改变，血管内皮细胞的活化在血管生成中起主要作用，其他细胞起辅助和支持作用，研究表明，血管内皮细胞活化后，胞内M T蛋白表达增加，激活NF -K B和A P -1信号通路，促进基质金属蛋白酶-9 (MM P - 9)的表达，后者能分解细胞周围的基质，促进内皮细胞的迁移和管腔形成，从而导致血管生成的加速，EOLAl可能通过在内皮细胞中与M T 2 A的相互作用影响着这条通路的活化，中饮用水有机污染物经过ADME过程作用于大鼠肝组织蛋白质，主要攻击蛋白质氨基酸的侧链而生成羰基；饮用水有机污染物代谢物(羟基自由基)直接作用于肽键，使肽键断裂并产生羰基；与非蛋白羰基化合物结合，如丙二醛是含氧的羰基化合物，它能够插入到蛋白质内部引起蛋白质羰基上升，说明饮用水有机物对大鼠肝脏的氧化损伤指标中，肝组织PCO比肝组织MDA更加敏感。
【具体实施方式】
[0006]下面对本发明进一步的详细说明，但不作为对本发明的任何限制。
[0007]本发明的实施例:
I材料与方法
1.1 材料
家兔购自第三军医大学实验动物中心，PET-46EK/LI C质粒购自美国N οvagen公司，人ECV304细胞株为西南医院烧伤实验室保存，Trizol提取试剂购自北京鼎国生物公司，RT P C R试剂盒购自大连T a k a r a公司，完全弗氏佐齐[J (comp I e t e F reund’ s a d j uvaant,CF A)和不完全弗氏佐齐 Li(i n c o m p I eteFreund’sadj uvaant,IFA)购自 G i b c ο BR L公司，免疫组织化学试剂盒购自VECTORLAB公司，蛋白提取试剂RIPABBuf f e r购自S i g m a公司，生物素标记二抗购自中衫金桥公司，E C L发光试剂盒购自P i e r c e公司，BL21(DE3)plys感受态细胞购自上海索莱宝生物科技有限公司。
[0008]1.2 制备目的蛋白
1.2.1 人ECV304细胞总RNA的提取-收集培养的人E C V 3 O 4细胞约5 X I O 7个，经P B S漂洗2次，按照T r i z ο I提取试剂说明操作，获得细胞总RN A样品后测A 2 6 O / A 2 8 O比值分析纯度，I %琼脂糖凝胶电泳分析。
[0009]1.2.2引物的设计与合成
根据E O L A I基因开放阅读框(ORF)序列设计上游引物5 ' — GACGACGACAAGATGAAGTTTGGCTGCC-3',下游引物5'-GAGGAGAAGCCCGGTTCACACTTCATG - Z'，交由上海生工生物工程有限公司合成。
[0010]1.2.3 细胞总 RN A的R T - P C R 按RT -PCR试齐[J
盒说明书配制2 O μ I反转录反应体系，反转录条件:5 O °C, 3 O m i η ；99°C，5min;4°C，5min。将所得结果加入8 O μ IPC R反应体系；P C R条件:9 4 °C 预变性 2 m i η，9 4 °C 变性 3 O s，5 9 °C 退火 3 O s，7 2 °C 延伸 I 5 m in，共3 O个循环；7 2°C延伸I Omi η，I %琼脂糖凝胶电泳分析后目的片段凝胶回收纯化。
[0011]1.2.4 重组质粒的构建及转化细菌
目的片段经T 4 DNA连接酶和d AT P处理成黏性末端，且与PET-46EK/LI C空质粒黏端互补，两者退火连接构建成重组质粒；将后者用热休克方法转化到非宿主表达菌(N ovaBlueSingles T M感受态细菌)，涂布于L B培养板(Am P 5 O m g / L )上过夜生长，应用菌落P C R的方法筛选出阳性单菌落，菌液标本送上海生工生物工程有限公司测序鉴定。
[0012]1.2.5 重组质粒转化宿主表达菌
将测序正确的菌株接种至L B培养板生长I 2 h，挑取单菌落，3 7 °C恒温摇菌过夜，按质粒提取试剂盒说明操作提取重组质粒；将后者用热休克方法转化到宿主表达菌BL21(DE3)plysS，PCR筛选阳性菌落，一7 O °C保存。
[0013]1.2.6 EOLAl在大肠杆菌中的表达及目的蛋白分析
挑取单菌落接种至L B培养液，3 7 1:摇菌培养I 2 h，将菌液以1:10 0接种于新鲜L B培养基(含Am P 5 O mg / L)，振荡摇菌2 5 h后至D 6 0 0 ^0.6 ;分成两组，一组加入异丙基β - D硫代半乳糖苷(I P T G)至终浓度为Immo I / L，诱导摇菌培养3 h，另一组不加I P T G摇菌培养3 h，分别取菌液1ml，离心收集菌体，PBS重悬后加2倍S D S上样缓冲液，超声波处理后8 5 °C加热3 m i η变性获I O倍浓缩体积的细菌总蛋白；分别另取菌液1ml，离心收集菌体，BugBus ter液Iml裂解后离心，取上清加2倍S D S上样缓冲液混合，8 5 °C加热3 m i η
变性获得细菌胞质可溶性组分；将沉淀用2Qmmol/LTrisHCl(pH7.