血管内皮生长因子受体2抗原肽-mhc i类分子单链三聚体dna疫苗及用图
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及编码血管内皮生长因子受体2抗原肽(KDR2)与主要组织相容性抗原I类分子(MHC I)的单链三聚体DNA疫苗(SCT-KDR2)的多核苷酸，以及此多核苷酸的用途。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一。恶性肿瘤的生长、浸润和转移必须依靠新生血管提供足够的营养才能实现。因此，以抑制或破坏肿瘤血管生成为目的的抗肿瘤血管生成疗法，已成为肿瘤学研究的热点之一。该治疗策略有其独特的优点:①血管内皮细胞具有遗传稳定性，不易产生耐药性；②药物最易到达作用部位，即血管表面；③对具有新血管生成的肿瘤都有效，具有通用性；④新生血管内皮细胞的有限破坏可使肿瘤细胞进入休眠状态并被诱导凋亡从而达到治疗肿瘤的目的。
[0003]血管生成过程受到促进因子和抑制因子的相互调节。主要的血管生成促进因子有:血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血管生成素(ang1genin)、转化生长因子(transforming growth factor, TGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)等。主要的血管生成抑制因子包括血管抑素(ang1statin)、内皮抑素(endostatin)和血小板因子-4等。血管生成促进因子必须与相应的受体结合，才能发挥作用。其中VEGF与表达在活化的血管内皮细胞上的相应受体VEGFR2 (VEGFR2)结合所引起的信号转导是血管生成中的限速步骤，在整个血管生成过程中发挥着最为关键的作用。业已证实，VEGF和VEGFR2过度表达与人类肿瘤的侵袭和转移呈正相关。研究发现，用VEGFR2胞外区(也称可溶性VEGFR2)与血管内皮细胞上VEGFR2竞争结合VEGF、或者用VEGF的单克隆抗体(bevacizumab，贝伐单抗)中和VEGF的活性、或者用VEGFR2的单克隆抗体结合VEGFR2、或者用小分子的受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKIs)等，阻断VEGFR2介导的信号转导途径，可显著抑制肿瘤细胞诱导的血管生成和肿瘤的生长，具有显著的抗肿瘤作用。但临床应用发现，部分肿瘤患者使用贝伐单抗治疗后，初期效果显著，但随后出现耐药。究其原因是由于肿瘤微环境中表达的Gall能模拟VEGF，通过与VEGFR2上的N-聚糖复合物结合，激活VEGFR2介导的信号途径，促进肿瘤血管新生。近年来，血管生成抑制因子的基础和临床研究也有了可喜的成果，实验表明内皮抑素、血管抑素和TNP-470在动物体内均能抑制肿瘤诱导的血管生成，抑制肿瘤的生长。基因重组的血管内皮抑素已经上市，被用于肿瘤治疗。但是血管生成抑制因子治疗肿瘤必须长期用药，一旦停止,肿瘤又会继续生长,并且血管生成抑制因子的合成和提取费时、费事、成本高,治疗费用昂贵。因此，寻找新的简单有效而廉价的抗肿瘤血管生成制剂是当务之急，只有获得新的药物，才能使肿瘤的抗血管生成治疗有更大的应用前景，才能真正造福于广大肿瘤患者。
[0004]如前所述，VEGF与表达在血管内皮细胞上的相应受体VEGFR2结合所引起的信号转导是血管生成中的限速步骤，在整个血管生成过程中发挥着最为关键的作用。因此，VEGFR2是抗肿瘤血管生成治疗的关键靶点之一，若能通过某种途径打破对VEGFR2的自身免疫耐受，诱导产生针对VEGFR2的免疫应答，破坏表达VEGFR2的血管内皮细胞，无疑是抗肿瘤血管生成治疗最经济、最有效的方法。DNA疫苗由于具有结构简单、稳定性好等优点，广为关注，但其主要不足是其免疫效果不尽人意。
【发明内容】
[0005]本发明的第一个目的是提供一种分离的编码血管内皮生长因子受体2抗原肽(KDR2)与主要组织相容性抗原I类分子(MHC I)的单链三聚体的多核苷酸(SCT-KDR2)，本发明的第二个目的是提供一种上述的多核苷酸编码的蛋白，本发明的第三个目的是提供包括上述的多核苷酸编码的载体和疫苗，本发明的第四个目的是提供一种上述的多核苷酸编码或蛋白的应用，本发明的第五个目的是提供一种上述的多核苷酸的制备方法。
[0006]为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案:
一种分离的编码血管内皮生长因子受体2抗原肽与主要组织相容性抗原I类分子的单链三聚体的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列至少有90%相同性:
Ca)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
[0007]为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案:
一种上述的多核昔酸所编码的蛋白，该蛋白的氣基酸序列如SEQ ID NO:2所不。
[0008]为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案:
一种载体，该载体含有上述的多核苷酸。
[0009]—种疫苗，该疫苗含有上述的多核苷酸。
[0010]一种药物组合物，该药物组合物含有安全有效量的上述的多核苷酸或其所编码的蛋白。
[0011]为了实现上述的第四个目的，本发明采用了以下的技术方案:
上述的多核苷酸用于制备治疗肿瘤的药物中的应用。
[0012]上述的蛋白用于制备治疗肿瘤的药物中的应用。
[0013]上述的蛋白用于制备KDR2特异性的细胞毒性T淋巴细胞的检测制剂中的应用。
[0014]为了实现上述的第五个目的，本发明采用了以下的技术方案:
一种制备上述的多核苷酸的方法，该方法包括以下的步骤:
①人工合成两条互补的编码b2m信号肽和H-2Db限制性的KDR2抗原表位的寡核苷酸链，退火后形成双链DNA，5’ -端含NheI酶切位点，3’ -端含SpeI酶切位点；
②人工合成两条互补的编码Linkerl的寡核苷酸链，退火后形成双链DNA，5’-端含SpeI酶切位点，3’ -端含HindIII酶切位点；将①和②所得到的双链DNA通过SpeI酶切位点链接，并经NheI和HindIII酶切后，插入到真核表达质粒pcDNA3.1 (+)中，构成pcDNA3.1 (+) /b2m 信号肽-KDR2_Linkerl ；
③RT-PCR从C57BL/6小鼠脾细胞克隆HID1^cDNA，5’ -端含NotI酶切位点，3，-端含XbaI酶切位点，酶切后，插入pcDNA3.l(+)/b2m信号肽-KDR2-Linkerl中，形成pcDNA3.1 (+) /b2m 信号肽-KDR2-Linkerl-H_2Db;
④RT-PCR从C57BL/6小鼠脾细胞克隆b2m的cDNA，5’ -端含Hindi 11酶切位点，3 ’ -端含BamHI酶切位点，酶切后，插入到pcDNA3.1 (+)/b2m信号肽-KDR2-Linkerl-H_2Db中，形成 pcDNA3.1 (+) /b2m 信号肽-KDR2-Linkerl-b2m-H_2Db;
⑤人工合成两条互补的编码Linker2的寡核苷酸链，退火后形成双链DNA，5’-端含BamHI酶切位点，3 ’ -端含NotI酶切位点，酶切后，插入到pcDNA3.1 (+) /b2m信号肽-KDR2-Linkerl-b2m-H-2Db中，形成 pcDNA3.1 (+) /b2m 信号肽-KDR2-Linkerl_b2m-Linker2-H-2Db，形成多核苷酸。
[0015]一种制备上述的疫苗的方法该方法包括多核苷酸的制备方法，然后以重组质粒pcDNA3.1 (+) /b2m 信号肽-KDR2-Linkerl-b2m-Linker2-H_2Db转化大肠埃希菌 DH5a，大量抽提质粒，经纯化后-20° C保存备用。
[0016]本发明构建抗原肽-MHC I类分子[即MHC I类分子重链和b2_微球蛋白(b2m)]单链三聚体(SCT)以提高DNA疫苗免疫效果的有效措施，SCT DNA疫苗皮内免疫能显著诱导抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，在抗肿瘤和抗感染中显示良好的应用前景。软件分析显示在小鼠的VEGFR2中存在MHC I类分子(H_2Db)限制性的CTL抗原表位(KDR2，aal033~1042)，本发明另外构建表达KDR2-b2m-H-2Db的SCT DNA疫苗，并研究其免疫效果以及抗肿瘤转移作用。并制备新的有效的抗肿瘤血管生成制剂，提高了抗肿瘤效果。
[0017]
【附图说明】
[0018]图1是本发明的SCT-KDR2的结构。
[0019]图2是本发明的SCT-KDR2在A293的表达。
[0020]图3是本发明的SCT-KDR2免疫后诱导的CTL对表达VEGFR2的靶细胞的杀伤活性。
[0021]图4是本发明的SCT-KDR2免疫后对肿瘤诱导的血管生成的影响。
[0022]图5是本发明的SCT-KDR2免疫后抗肿瘤转移作用。
【具体实施方式】
[0023]本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0024]实施例1:SCT_KDR2 DNA疫苗的构建和制备
该DNA疫苗所用的真核表达载体为pcDNA3.1 (+) (Invitrogen)。它含有CMV启动子、SV40复制起始点、新霉素抗性基因，可进行目的基因的短暂表达和稳定表达。外源基因克隆位点的两端分别是含有T7启动子和牛生长激素BGH的polyA信号，可用T7和BGH通用引物对目的外源基因进行直接测序。
[0025]1.1编码b2m信号肽和H_2Db限制性的KDR2抗原表位的寡核苷酸链的制备人工合成两条互补的编码b2m信号肽和H-2Db限制性的KDR2抗原表位的寡核苷酸链，
序列如下:有义链:5’-CATGCTAGCATGGCTCGCTC GGTGACCCTAGTCTTTCTGGT GCTTGTCTCACTGACCGGCTTGTATGCTGTCATCCTCACCAACCCCATTTCAATGACTAGTGGTG-3’，反义链:5’ -CACCACTAGTCATTGAAATGGGGTTGGTGAGGATGACAGCAT ACAAGCCGGTCAGTGAGACAAGCACCAGAAAGACTAGGGTCACCGAGCGAGCCATGCTAGCATG-3’，退火后形成双链DNA (5’ -端含NheI酶切位点，3’ -端含SpeI酶切位点)。
[0026]1.2编码Linkerl的寡核苷酸链的制备及重组质粒的构建
人工合成两条互补的编码Linkerl的寡核苷酸链，序列如下:有义链:5’ -GACTA GTGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGAG GTTCTAAGCTTGGG-3 ’，反义链:5，-CCCAAGCTTAGAACCTCCGCCACCAGA ACCTCCG CCACCAGAACCTCCGCCACCAGAACCTCCGCCACCACTAGTC-3’。退火后形成双链DNA (5，-端含SpeI酶切位点，3’ -端含HindIII酶切位点)。
[0027]将1.1和1.2所得到的双链DNA通过SpeI酶切位点链接，并经NheI和HindIII酶切后,插入到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构成pcDNA3.1 (+)/b2m信号肽-KDR2_Linkerl。
[0028]1.3 RT-PCR克隆无信号肽编码序列的H_2Db cDNA及及重组质粒的构建
用 Trizol (Invitrogen)提取 C57BL/6 小鼠脾细胞总 RNA。以 First Strand cDNASynthesis Kit (Fermentas)将2mg总RNA逆转录成cDNA,逆转录体系为20ml。PCR扩增H-2Db cDNA 所用的引物如下:有义引物:5’ -TT6tKKO7(?6GGCCCACACTCGATGCGGT-3’，反义引物:5’-GCTCTAGATCACGCTTTACAATCTCGG AG-3’。PCR 反应体积为 50ml，其中含逆转录模板2ml、0.4mM 引物、0.2mM dNTP 和 IU Blend Taq DNA 聚合酶(Takara)。扩增参数为 94。C20秒、62 ° C 30秒、72 ° C 60秒，30个循环后PCR产物行I %琼脂糖凝胶电泳初步确认。DNA序列测定结果表明