该PCR产物的编码DNA序列与GenBank中无信号肽编码序列的H_2Db(U47325)编码序列完全相同(5’ -端含NotI酶切位点，3’ -端含XbaI酶切位点)。
[0029]H-2Db cDNA 经 NotI 和 XbaI 双酶切后，插入 pcDNA3.1 (+) /b2m 信号肽-KDR2-Linkerl 中，形成 pcDNA3.1 (+) /b2m 信号肽-KDR2-Linkerl-H_2Db。
[0030]1.4 RT-PCR克隆无信号肽编码序列的b2m cDNA及重组质粒的构建
用 Trizol (Invitrogen)提取 C57BL/6 小鼠脾细胞总 RNA。以 First Strand cDNASynthesis Kit (Fermentas)将2mg总RNA逆转录成cDNA,逆转录体系为20ml。PCR扩增b2m cDNA 所用的引物如下:有义引物:5’ -CCCAAGCTTATCCAGAAAACCCCTCAAATTC-3’，反义引物:5’ -CGGGATCCCA TGTCTCGATCCCAGTAGAC-3’。PCR 反应体积为 50ml，其中含逆转录模板 2ml、0.4mM 引物、0.2mM dNTP 和 IU Blend Taq DNA 聚合酶(Takara)。扩增参数为 94。C30秒、57 ° C 30秒、72 ° C 30秒，30个循环后PCR产物行I %琼脂糖凝胶电泳初步确认。DNA序列测定结果表明该PCR产物的编码DNA序列与GenBank中无信号肽编码序列的b2m(X01838)cDNA序列完全相同(5’_端含HindIII酶切位点，3’-端含BamHI酶切位点)。b2mcDNA 经 HindIII 和 BamHI 双酶切后，插入到 pcDNA3.1 (+) /b2m信号肽-KDR2-Linkerl-H_2Db中，形成 pcDNA3.1 (+) /b2m 信号肽-KDR2-Linkerl-b2m-H_2Db。
[0031]1.5编码Linker2的寡核苷酸链的制备及重组质粒的构建
人工合成两条互补的编码Linker2的寡核苷酸链，序列如下:有义链:5’-CGCGGATCCGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGAGGTTCTG GTGGCGGAGGTTCT-3’，反义链:5’ -TTGCGGCCGCAAGAACCTCCGCCACCAGAACCT CCGCCACCAGAACCTCCGCCACCAGAACCTCCGCCACC-3，。退火后形成双链DNA (5’ -端含BamHI酶切位点，3’ -端含NotI酶切位点)。Linker2 cDNA经BamHI 和 NotI 双酶切后，插入到 pcDNA3.1 (+) /b2m 信号肽-KDR2-Linkerl-b2m-H_2Db中，形成(即 SCT-KDR2)。
[0032]所构建的表达SCT-KDR2的基因重组质粒——pcDNA3.1 (+) /b2m信号妝-KDR2-Linkerl-b2m-Linker2-H_2DbS因序列经测序验证。
[0033]1.6 SCT-KDR2 疫苗的制备
以重组质粒 pcDNA3.1 (+) /b2m 信号肽-KDR2-Linkerl-b2m-Linker2-H_2Db转化大肠埃希菌DH5a，大量抽提质粒，经纯化后-20° C保存备用。
[0034]实施例2:SCT_KDR2在A293细胞的表达
根据 LipofectamineTM 2000 (Invitrogen)试剂盒说明书，用 Lipofectamine 法以SCT-KDR2转染A293细胞，在37° C、5% C02条件下培养36 h后收集细胞。用FITC-标记的大鼠抗小鼠H-2Db单克隆抗体(BD Pharmingen, CA, USA)标记，流式细胞术检测A293细胞表面SCT-KDR2的表达。
[0035]实施例3:SCT-KDR2皮内免疫诱导针对VEGFR2的CTL应答
分别用SCT-KDR2、SCT-OVA (表达H_2Db限制性卵白蛋白抗原肽的SCT DNA疫苗)和Vector [pcDNA3.1 (+)]皮内免疫小鼠(每鼠50mg) 3次，每次间隔7日。最后一次免疫后10日，无菌制备免疫小鼠脾脏单细胞悬液，以Tris-NH4Cl破除红细胞，经Hanks液洗涤3次，用RPMI1640完全培养液配成f 17细胞/ml。与丝裂霉素(50mg/ml)灭活的血管内皮细胞系H5V混合(脾细胞:H5V=10:1)，在50U/ml IL-2存在的条件下，于37° C、5% C02条件下培养7日。收获存活的淋巴细胞作为效应细胞，VEGFR2+的H5V、3LL-sflkl、以及VEGFR2—的EL-4和3LL作为靶细胞，根据Promega试剂盒说明书，以LDH释放法测定CTL活性，效靶比分别为12.5: 1，25:1和50:1。根据下列公式计算CTL杀伤活性:
CTL杀伤活性(％) =10(Τ (实验组-效应细胞自发释放组-靶细胞自发释放组)/(靶细胞最大释放组-靶细胞自发释放组)
实施例4:SCT-KDR2皮内免疫抑制肿瘤诱导的血管生成
分别用SCT-KDR2、SCT-OVA (表达H_2Db限制性卵白蛋白抗原肽的SCT DNA疫苗)和Vector [pcDNA3.1 (+)]皮内免疫小鼠(每鼠50mg) 3次，每次间隔7日。最后一次免疫后10日，分别用藻酸钠小珠法和免疫组化法测定SCT-KDR2免疫对肿瘤诱导的血管形成的影响。
[0036]4.1藻酸钠小珠法测定SCT-KDR2免疫对肿瘤诱导的血管形成的影响
将培养的3LL Lewis肺癌细胞悬于1.5%的藻酸钠溶液中，逐滴加到37° C预温的250mmol/L的CaCl2溶液中，形成包含肿瘤细胞的藻酸钠小珠(5' 10 4细胞/珠)。给经免疫的3组小鼠(每组8?10只小鼠)背侧皮下移植该藻酸钠小珠(4颗/鼠)，12日后，经尾静脉每鼠注射10ml浓度为20mg/ml的FITC-Dextran，20分钟后处死小鼠，取出小珠，浸泡在ImlρΗ8.0的Tris-HCl (lmmol/L)中，室温过夜，次日用匀浆机粉碎小珠，补假Iml Tris-HCl，1500rpm离心5分钟，用荧光比色仪测定上清中的荧光强度，激发波长492nm，发射波长515nm,通过与FITC-Dextran标准曲线比较,计算每小珠FITC-Dextran的摄取量，结果以ng/珠表不。
[0037]4.2免疫组化法检测SCT-KDR2免疫对肿瘤诱导的血管形成的影响
最后一次免疫后10日，C57BL/6小鼠(5只/组)皮下接种ΓΙΟ5 B16黑色素瘤细胞，10日后切除肿瘤固定于10%福尔马林，经石蜡包埋，制备5-mm组织切片。用SABC免疫组化法检测血管内皮细胞表达的VIII相关抗原。即经脱蜡后，切片用0.3% H2O2孵育30分钟，灭活内源性过氧化物酶，0.0lM pH7.4 PBS洗涤。切片用兔抗VIII相关抗原多抗4° C孵育过夜(1:200; Cell Marque),TBST (pH7.6)洗涤后，用生物素化的羊抗兔IgG(1:1000;Jackson ImmunoResearch)室温孵育 30 分钟，洗漆后，加 Strepavidin-HRP (Sigma)室温孵育30分钟。然后加含0.05%DAB (Fluka)和0.01% H2O2的底物溶液显色，HE背染。
[0038]实施例5:SCT_KDR2皮内免疫的抗肿瘤转移作用
分别用SCT-KDR2、SCT-OVA和Vector皮内免疫小鼠(每鼠50mg) 3次，每次间隔7日。最后一次免疫后10日，用于观察SCT-KDR2免疫的抗肿瘤转移作用。
[0039]5.1黑色素瘤转小鼠移模型
第3次免疫后10日，经尾静脉给每只小鼠注射Γ 16 B16黑色素瘤细胞(每组10只小鼠)，第28天处死小鼠，计数小鼠肺表面肿瘤转移灶的数目。
[0040]5.2 3LL Lewis肺癌小鼠转移模型
第3次免疫后10日，给每只小鼠(每组10只小鼠)足垫内注射2' 105 3LL Lewis肺癌细胞，当肿瘤直径达到6mm时，截去荷瘤小腿，对照组出现死亡时，处死小鼠，计数小鼠肺表面转移灶的数目。
【主权项】
1.一种分离的编码血管内皮生长因子受体2抗原肽与主要组织相容性抗原I类分子的单链三聚体的多核苷酸，其特征在于:该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列至少有90%相同性: Ca)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示； (b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
2.—种权利要求1所述多核苷酸所编码的蛋白，其特征在于:该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
3.—种载体,其特征在于:该载体含有权利要求1所述的多核苷酸。
4.一种疫苗，其特征在于:该疫苗含有权利要求1所述的多核苷酸。
5.权利要求1所述的多核苷酸用于制备治疗肿瘤的药物中的应用。
6.权利要求2所述的蛋白用于制备治疗肿瘤的药物中的应用。
7.权利要求2所述的蛋白用于制备KDR2特异性的细胞毒性T淋巴细胞的检测制剂中的应用。
8.—种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有安全有效量的权利要求1所述的多核苷酸或其所编码的蛋白。
9.一种制备权利要求1所述的多核苷酸的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤: ①人工合成两条互补的编码b2m信号肽和H-2Db限制性的KDR2抗原表位的寡核苷酸链，退火后形成双链DNA，5’ -端含NheI酶切位点，3’ -端含SpeI酶切位点； ②人工合成两条互补的编码Linkerl的寡核苷酸链，退火后形成双链DNA，5’-端含SpeI酶切位点，3’ -端含HindIII酶切位点；将①和②所得到的双链DNA通过SpeI酶切位点链接，并经NheI和HindIII酶切后，插入到真核表达质粒pcDNA3.1 (+)中，构成pcDNA3.1 (+) /b2m 信号肽-KDR2_Linkerl ； ③RT-PCR从C57BL/6小鼠脾细胞克隆HID1^cDNA，5’ -端含NotI酶切位点，3，-端含XbaI酶切位点，酶切后，插入pcDNA3.l(+)/b2m信号肽-KDR2-Linkerl中，形成pcDNA3.1 (+) /b2m 信号肽-KDR2-Linkerl-H_2Db; ④RT-PCR从C57BL/6小鼠脾细胞克隆b2m的cDNA，5’ -端含Hindi 11酶切位点，3 ’ -端含BamHI酶切位点，酶切后，插入到pcDNA3.1 (+)/b2m信号肽-KDR2-Linkerl-H_2Db中，形成 pcDNA3.1 (+) /b2m 信号肽-KDR2-Linkerl-b2m-H_2Db; ⑤人工合成两条互补的编码Linker2的寡核苷酸链，退火后形成双链DNA，5’-端含BamHI酶切位点，3 ’ -端含NotI酶切位点，酶切后，插入到pcDNA3.1 (+) /b2m信号肽-KDR2-Linkerl-b2m-H-2Db中，形成 pcDNA3.1 (+) /b2m 信号肽-KDR2-Linkerl_b2m-Linker2-H-2Db，形成多核苷酸。
10.—种制备权利要求4所述的疫苗的方法，其特征在于:该方法包括权利要求9所示的多核苷酸的制备方法，然后以重组质粒pcDNA3.1 (+)/b2m信号肽-KDR2-Linkerl-b2m-Linker2-H-2DbR化大肠埃希菌DH5a,大量抽提质粒，经纯化后-20° C保存备用。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，本发明提供了一种新的编码主要组织相容性抗原I类分子（H-2Db）限制性的血管内皮生长因子受体2抗原肽KDR2、b2微球蛋白（b2m）和H-2Db的单链三聚体DNA疫苗（SCT-KDR2，其核苷酸序列见SEQ ID NO：1所示），和经重组技术产生这种SCT-KDR2 DNA疫苗的方法。本发明还提供了这种SCT-KDR2 DNA疫苗的用途以及此DNA疫苗在肿瘤等疾病治疗中的用途。
【IPC分类】C12N15-63, A61K38-17, A61P35-00, A61K48-00, C07K19-00, C12N15-62
【公开号】CN104531735
【申请号】CN201410603276
【发明人】潘建平, 张立煌, 张大勇, 张翀, 方洁, 全胜, 王宝明
【申请人】浙江大学城市学院
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年10月30日