一种添加二硫键以提高阿魏酸酯酶a热稳定性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及宇佐美曲霉（Aspergillususamii)E001菌株阿魏酸醋酶A(AuFaeA) 基因的热稳定性改造，突变阿魏酸酯酶A工程菌的构建及重组突变阿魏酸酯酶A的高效表 达，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸酯酶（EC3. 1. 1. 73)又称肉桂酸酯酶，是羧酸水解酶的一个亚类，属于胞 外酶，能打断半纤维素之间的、半纤维素与木质素之间交联的酯键，是半纤维素降解酶系的 组成成分之一。自1991年Faulds等首次分离出阿魏酸酯酶以来，已有超过30种阿魏酸酯 酶被克隆、表达及纯化，其主要生物功能是水解植物细胞壁中多糖与阿魏酸连结的酯键，释 放出游离的单体阿魏酸或阿魏酸二聚体。但研宄结果表明，天然阿魏酸酯酶的热稳定性一 般较差，成为其在食品加工、饲料（制粒）、造纸行业（纸浆漂白）等诸多领域中应用的瓶 颈。
[0003] 由于高温生物工程环境限制了阿魏酸酯酶的应用，所以人们加强了对酶热稳定性 的研宄。希望可以通过提高酶作用温度和增加酶热稳定性，从而提高酶作用效率，以达到降 低工业生产成本的目的。目前，开发耐热型阿魏酸酯酶的研宄主要包括筛选自然界中超耐 热的阿魏酸酯酶生产菌和利用蛋白质工程技术等对酶分子进行定向改造，相对于筛菌技术 的盲目性，后者具有更强的针对性，受到国内外学者的青睐。随着基因工程技术、生物信息 学等的快速发展，为分子生物学的研宄开辟了新的道路。通过运用大规模高性能的计算机 及其相关软件，结合基因工程手段，利用模拟试验对酶分子进行定向改造以提高热稳定性， 从而扩大阿魏酸酯酶的应用面。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种阿魏酸酯酶A热稳定性改造、突变阿魏酸酯酶A工程菌 构建以及突变阿魏酸酯酶A高效异源表达的方法。
[0005] 本发明的技术方案：根据来源于A.usamiiE001阿魏酸醋酶A(AuFaeA)的空 间结构设计突变A126C和N152C，得到突变阿魏酸酯酶A:AuFaeAA126G_N152G，其成熟肽基因 AufaeAA126Mll52C序列为SEQIDNO: 1，C126 和C152 可以形成二硫键。
[0006] 所述的由成熟肽基因编码得到的AuFaeAA126G-N152G氨基酸序列为SEQIDN0:2。
[0007] 所述的重组阿魏酸酯酶A的活性测定方法：
[0008] 以阿魏酸甲酯（MFA)为底物，高效液相（HPLC)分析阿魏酸的释放量。具体操作为： 移取900yLMFA(lmM，pH6. 0)于2mLEP管中，45°C保温lOmin，加入lOOyL适当稀释的 酶液，反应lOmin后加入400yL冰乙酸终止反应，立即混匀进行高效液相分析。以先在酶 溶液中加入400yL冰乙酸，再加底物溶液为对照。色谱条件：以甲醇、1 %乙酸一步梯度洗 脱，在10min内，甲醇浓度由50%上升至80%，流速lmL/min，柱温30°C，检测波长320nm，上 样量20yL。根据峰面积，从标准曲线查出相应的阿魏酸量，从而计算酶活。酶活单位定义： 在测定条件下（45°C、pH6. 0)每分钟产生1ymol阿魏酸所需的酶量为一个酶活单位（U)。
[0009] 所述的突变阿魏酸酯酶A基因的设计、克隆及表达：
[0010] (1)氨基酸残基突变位点的选定：以黑曲霉阿魏酸酯酶A的三维结构（1UWC)为模 板，用Modeller9. 9 软件模拟出AuFaeA的三维结构。利用DiscoveryStudio3.OClient、 PyMOL和DisulfideByDesign软件对模拟的三维结构进行分析，并用gromacs-4. 5程序包 对改造前后的三维结构进行动力学模拟，最终确定氨基酸残基突变位点。
[0011] ⑵突变基因AufaeAA1M52e及其表达质粒的构建：根据已申请发明专利（申请 号：201210181372.X)中核苷酸序列及突变位点特点设计突变引物126-F，152-R:
【主权项】
1?一种改造后的源自宇佐美曲霉（Aspergillus usamii)E001的阿魏酸醋酶A基因 AufaeAA1?，其对应的核苷酸和蛋白质序列分别为SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2。
2.突变阿魏酸酯酶A工程菌的构建方法和表达方法： (1)突变残基位点的选定：以黑曲霉阿魏酸酯酶A的三维结构（1UWC)为模板，用 Modeller 9. 9 软件模拟出 AuFaeA 的三维结构，利用 Discovery Studio 3.0 Client、PyMOL 和Disulfide By Design软件对模拟出的三维结构进行分析，并用gromacs-4. 5程序包对 改造前后的三维结构进行动力学模拟，最终确定氨基酸残基突变位点； ⑵突变基因AufaeAA1M52e的克隆及其表达质粒的构建：根据已申请发明专利（申请 号：201210181372. X)中核苷酸序列及突变位点特点设计突变引物126-F，152-R : 126-F :5' -ATCCGGACTATTGCCTTACCGTGACA-3'， 152-R :5' -GTACAGACGGACGCAGTCATATGTCGC-3'， 以本实验室保存的pUCm-T-AufaeA为模板，以126-F，152-R为引物进行第一轮PCR，获 得基因片段AufaeA126_152;以pUCm-T-AufaeA为模板，以第一轮PCR产物AufaeA 126_152为引 物与已申请发明专利（【申请号】201210181372.X)中特异性引物FAE-F进行第二轮大引物 PCR，获得基因片段AufaeA F_152;以pUCm-T-AufaeA为模板，以第二轮PCR产物AufaeA F_152为 引物与已申请发明专利（【申请号】201210181372.X)中特异性引物FAE-R进行第三轮大引 物PCR，将第三轮PCR产物Auf aeAA1M52% 1 %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并 与pUCm-T连接（pUCm-T-AufaeAA1?)，转化JM109,经酶切鉴定正确后送上海生工测序； (3) 重组表达质粒的构建：将测序结果正确的pUCm-T-AufaeAA126G_N152^ pPIC9K质粒均 用EcoR I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接， 得到重组表达质粒pPIC9K-AufaeAA1? (图1)，并对重组表达质粒进行序列测定； (4) GS115/AufaeAA1M52e重组子的构建、表达及酶学特性的测定：用Sal I对 pPIC9K-AufaeAA1M52G进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的 毕赤酵母重组子GS115/AufaeA A1?;按照手册上的标准流程进行诱导表达，用1.0%甲 醇诱导72h ;离心上清液为重组突变阿魏酸酯酶A粗酶液，经SDS-PAGE检测为单一条带，该 重组阿魏酸酯酶最适反应温度为50°C，较原酶提高了 5°C，60°C下的半衰期达40min。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种阿魏酸酯酶A热稳定性改造、突变阿魏酸酯酶A工程菌构建以及突变阿魏酸酯酶A高效异源表达的方法。根据来源于A.usamii E001阿魏酸酯酶A(AuFaeA)的空间结构设计突变A126C和N152C，得到突变阿魏酸酯酶A：AuFaeAA126C-N152C，其成熟肽基因序列为SEQ ID NO:1，C126和C152可以形成一个二硫键。实验结果表明突变后该酶热稳定性有了明显的提高，为其它酶的改造提供新的技术路径，作为一种耐热型的酶制剂，该阿魏酸酯酶具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
【IPC分类】C12N15-66, C12N9-18, C12R1-84, C12N15-81, C12N15-55
【公开号】CN104531729
【申请号】CN201410758084
【发明人】邬敏辰, 殷欣, 余涛, 李剑芳, 姚瑶, 何瑶
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月10日