生产啶南平的方法
【专利说明】生产啶南平的方法 本申请为2011年1月19日提交的、发明名称为"生产啶南平的方法"的PCT申请PCT/JP2011/050851的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2012年7月26日， 申请号为 201180007262. 5。
[与相关申请的交叉引用]
[0001] 此专利申请要求在2010年1月26日提交的日本专利申请号14727/2010的优先 权，将其全部公开引入本文作为参考。
[发明背景]
[0002] 发明领域 本发明涉及一种生产陡南平（pyripyropene)的方法，更具体地，一种生产陡南平A,E, 〇等的方法。
【背景技术】
[0003] 如在日本专利特开公报号（Laid-OpenPublicationNo. ) 360895/1992 (专利文 件 1)和JournalofAntibiotics(1993)，46(7)，1168_9(非专利文件 1)中公开的陡南平 A，具有针对ACAT(酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶）的抑制活性，有望将其应用于治疗由胆 固醇积累引起的疾病等等。
[0004] 作为产卩定南平A的真菌，烟曲霉（Aspergillusfumigatus)F0-1289菌株已在日 本专利特开公报号360895/1992 (专利文件1)中公开；Eupenicilliumreticulosporum NRRL-3446 菌株已在AppliedandEnvironmentalMicrobiology(1995) ,61(12)， 4429-35 (非专利文件2)中公开：灰黄青霉（Penicilliumgriseofulvum)F1959菌株已在 W02004/060065 (专利文件 2)中公开:和粪牛.青霉（Penici1 1iumcoprobium)PF1169 菌 株已在JournalofTechnicalDisclosure500997/2008 (专利文件 3)中公开。
[0005]此外，作为陡南平A的生物合成途径，在JournalofOrganicChemistry(1996)， 61，882-886 (非专利文件 3)和ChemicalReview(2005)，105,4559-4580(非专利文件 4) 中已公开了在烟曲霉F0-1289菌株中假定的牛物合成涂径。这些文件公开了在里血皇 F0-1289菌株中，通过环化酶连接分别由聚酮合酶或异戊烯转移酶合成的部分结构以合成 啶南平A。
[现有技术参考]
[专利文件]
[0006] [专利文件1]日本专利特开公报号360895/1992 [专利文件 2]W02004/060065
[专利文件 3]JournalofTechnicalDisclosure5〇0"7/2〇〇8 [非专利文件]
[0007][非专利文件 1]JournalofAntibiotics(1993)，46 (7)，1168-9.
[非专利文件2]AppliedandEnvironmentalMicrobiology(1995)，61 (12)，4429-35. [非专利文件 3]JournalofOrganicChemistry(1996)，61，882_886.
[非专利文件 4]ChemicalReview(2〇〇5)，l〇5,4559_458〇.
[发明概述]
[0008] 本发明者现在发现，能够通过用啶南平A生物合成所必需的中间体化合物培养微 生物生产啶南平A或类似物，在所述微生物中引入特定多核苷酸或包含其的重组载体。已 基于这些发现产生了本发明。
[0009] 因此，本发明的一个目的是提供一种生产啶南平A的方法。
[0010] 此外，根据本发明的一个实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在于 用啶南平E培养导入有以下（I)至（III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体的 微生物，并通过啶南平0分离啶南平A: (I) 分离的多核苷酸，其具有选自以下（a)至（d)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序 列： (a) SEQIDN0:266的核苷酸序列， (b) 核苷酸序列，其能够在严格条件下与SEQIDN0:266的核苷酸序列的互补序列杂 交，且其编码与SEQIDN0:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白， (c)SEQIDN0:266的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添 加了一个或多个核苷酸，且其编码与SEQIDN0:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的 蛋白，和 (d) 核苷酸序列，其与SEQIDN0:266的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一 性，且其编码与SEQIDN0:266的核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白； (II) 分离的多核苷酸，其具有编码选自SEQIDN0:267至275的至少一个氨基酸序列 或与其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和 (III) 分离的多核苷酸，其具有选自以下（1)至（4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸 序列： (1)在以下（a)至⑴中的核苷酸序列： (a) SEQIDN0:266中显示的核苷酸序列的从3342至5158的核苷酸序列， (b)SEQIDN0:266中显示的核苷酸序列的从5382至12777的核苷酸序列， (c)SEQIDN0:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核苷酸序列， (d)SEQIDN0:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核苷酸序列， (e)SEQIDN0:266中显示的核苷酸序列的从18506至19296的核苷酸序列， (f)SEQIDN0:266中显示的核苷酸序列的从19779至21389的核苷酸序列， (g)SEQIDN0:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的核苷酸序列， (h)SEQIDN0:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的核苷酸序列，和 (i)SEQIDN0:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核苷酸序列； (2) 核苷酸序列，其能够在严格条件下与（1)中的核苷酸序列的互补序列杂交，且其编 码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白； (3) (1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一个 或多个核苷酸，且其编码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白；和 (4) 核苷酸序列，其与（1)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一'丨生，且其编 码与每个核苷酸序列编码的蛋白基本等同的蛋白。
[0011] 另外，根据本发明的另一个实施方案，提供了一种生产啶南平A的方法，其特征在 于用去乙酰啶南平E培养微生物，其中引入上述（I)至（III)中的至少一种多核苷酸或包 含其的重组载体，并通过啶南平E和啶南平0分离啶南平A。
[0012] 此外，根据本发明的另一个实施方案，提供了一种生产4-羟基-6-(吡 啶-3-基）-3-((2E，6E)-3, 7, 11-三甲基十二碳-2, 6, 10-三烯）-2H-吡喃-2-酮 (4-hydroxy-6-(pyridin-3-yl)-3-((2E, 6E)-3, 7, 11-trimethyldodeca-2, 6,l〇-trienyl)-2H-pyran_2-〇ne)的方法，其特征在于用4-氧-6_(3-批陡基）_a-批 喃酮（4-〇x〇-6-(3-pyridyl)_a-pyrone)培养微生物，其中引入上述（I)至 (III)中的至少一种多核苷酸或包含其的重组载体，并分离4-羟基-6-(吡 啶-3-基）-3- ((2E，6E) -3, 7, 11-三甲基十二碳-2, 6, 10-三烯）-2H-吡喃-2-酮。
[0013] 根据本发明的另一个实施方案，提供了上述（I)至（III)中的至少一种分离的多 核苷酸。
[0014] 此外，根据本发明的另一个实施方案，提供了重组载体，其选自PPP6 (用质粒PPP6 转化的米曲霉（Aspergillusoryzae)的登记号:FERMBP-11218)，pPP7 (用质粒pPP7转化 的米曲霍的登记号:FERMBP-11219)和pPP9 (用质粒pPP9转化的激血靈的登记号：FERM BP-11220)。
[0015] 此外，根据本发明的另一个实施方案，提供了转化体，其包含选自质粒pPP6,pPP7 和pPP9的一种或多种载体。
[0016] 根据本发明的另一个实施方案，提供了上述重组载体用于生产啶南平A的用途。
[0017] 根据本发明的另一个实施方案，提供了上述转化体用于生产啶南平A的用途。
[0018] 根据本发明的生产方法，能够通过基因重组技术生产啶南平A，E，0等等。因此本 发明的生产方法对啶南平A，E，0等等的大量生产技术具有重大贡献。
[附图简述]
[0019] [图1]图