一种嵌合抗原受体t细胞及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法，本发明的嵌合抗原受体T细胞具有特定的食管癌相关功能活性，对食管癌的治疗具有重要的潜在和实际价值，为食管癌的治疗提供一个新的技术方向。
【专利说明】
一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种基因工程技术领域，尤其是一种食管癌相关的嵌合抗原受体T细 胞及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 癌症一直是困扰人类的巨大难题。我国每年新发肿瘤病例约为312万例，平均每天 8550人意味着每分钟就有6人就诊断为恶性肿瘤，这些数据都表明，癌症依然是威胁健康的 一大杀手。多年来，癌症治疗的方法主要是手术、化疗和放疗，对肿瘤患者的临床治疗有效 率仍旧很低，据统计，同一种抗肿瘤药物的有效率仅为25%。针对同一种肿瘤，用同样的药、 标准剂量的治疗方法，在不同病人身上所起的疗效及毒副作用却有很大的差异。造成这种 结果的主要原因在于，肿瘤是一种多病因、异质性的疾病。过去十年来，依赖于患者个体生 物标志物的肿瘤个性化治疗正在逐渐取代依据传统经验的治疗模式，并展现出优越的疗效 和广阔的前景，如伊马替尼和曲妥珠单抗。
[0003] 免疫疗法是继手术、化疗、放疗和靶向疗法后出现的一种新型疗法，被称为治疗癌 症的"第五大疗法"。它是利用患者自身免疫系统的力量来抵抗癌症;癌症免疫疗法主要包 括过继性细胞治疗、免疫调节剂、肿瘤疫苗以及免疫结合点阻断治疗等。虽然有关免疫治疗 的研究早在30年前就已开展，最近两年《细胞》、《科学》、《自然》等国际顶级期刊刊出多项该 领域的突破研究成果，制药巨头也不断推出此类型的重镑疗法。2014年12月6号-9号在旧金 山举行的美国血液学会年会(ASH)上，癌症免疫疗法可谓是赚足了眼球，CAR-T疗法更是备 受关注。
[0004] CART的概念是以色列ZeligEshhar博士上世纪80年代提出的，1989首次开发出嵌 合抗原受体T细胞。CART疗法即嵌合抗原受体T细胞疗法，绕过了 PD疗法启动过继免疫应答 这一难关，开创了跨越式发展的医学史新篇章。CART针对那不怎么靠谱的过继免疫，引入全 新的概念与方法，成功地诱导出抗癌的过继免疫应答。首先CART解决了抗原的难题。既然在 自然的状况下免疫系统找不到抗原，那就人为指定一种抗原。考察急性淋巴B细胞白血病的 CART疗法。淋巴B细胞表面有一个分化抗原CD19,无论是正常B细胞还是癌变B细胞都有表 达。选CD19为靶抗原可以确保没有漏网之鱼。接下来，怎样确保T细胞能找到CD19靶抗原?这 也是CART的核心技术。自然的T细胞肯定不会将⑶19当作靶抗原的。⑶19表达于正常B细胞， T细胞对CD19耐受。CART将一个抗原受体嵌合到T细胞表面。这抗原受体本质是一种抗体，对 CD19有很高的亲和性。两者碰到就会结合，不离不弃。于是，用抗体蛋白联接定位，T细胞就 钉住了癌细胞。所以有一比喻，这抗原受体就像GPS，给T细胞导航，为找到目标提供了保证。 抗体又是怎样插入进T细胞的?这是通过基因转染技术实现的。这里转染的并不是抗体本身 而是编码抗体的基因，也就是说转染的是DNA。转染的DNA会编码抗体然后表达于T细胞表 面。
[0005] 仅仅嵌合了抗体的T细胞疗法是第一代CART，解决了靶抗原或第一信号的问题。但 是临床效果差強人意，原因是第二信号即共刺激信号的缺失。没有共刺激信号T细胞仍然没 法激活，那样就算钉住了癌细胞也没有战斗力。产生共刺激信号需要T细胞和抗原提呈细胞 之间的互动。可是抗原提呈细胞也需要第一信号。这样势必还要将同样的抗体嵌合进抗原 提呈细胞如DC，过于复杂了。于是，针对共刺激信号又开发出第二代CART。第二代CART在靶 向⑶19的基础上，加入了⑶28或⑶137, T细胞上的共刺激受体。T细胞的信号域包括:⑶3ζ(Τ 细胞抗原受体信号转导的组成成分)--CD28,或CD3G-一CD137。免疫应答的贯序可表述 为:CD 19激活抗体，抗体激活CD28(CD 137)，CD28 (CD 137 )激活CD3G。可以说，第二代CART同时 解决了第一信号和第二信号，不再依赖不怎么靠谱的肿瘤相关抗原，不再依赖抗原提呈细 胞，也不必担心MHC的低表达。第三代CART的特点是在⑶28之后又加入了共刺激分子蛋白 0X40或4-1ΒΒ(4-1ΒΒ就是⑶137)。这两种共刺激分子蛋白可进一步活化T细胞，延长生存期。 三代CART技术的演化反映了共刺激分子的重要作用。
[0006] 急性淋巴B细胞白血病的CART疗法获得了惊人的90%-100%的响应率，长期有效，不 少病患完全缓解也就是临床痊愈了。更何况，这些入组CART的病患都是化疗失败、骨髓移植 后复发等就快走投无路重病患。CART将会成为人类历史上伟大里程碑:真正治愈癌症的方 法。
[0007] 推广CART疗法的主要障碍来自脱靶效应。像CD19不是肿瘤的靶点，而是B细胞本身 的靶点。肿瘤细胞清除掉的同时B细胞也被清除掉了。这已不是杀敌一千，自伤八百。更不是 杀敌一千，自伤八十。而是宁可错杀一千，绝不放过一个。好在患者没有B细胞照样可以生 存，只要定期输入丙种免疫球蛋白即可。只要靶点不是百分百肿瘤特异性，就会有脱靶效 应，这是CART副作用的主要来源。据报道，一例以HER2为靶抗原针对结肠癌的第三代CART治 疗，病人输入CART十五分钟后出现呼吸窘迫，五天后死亡。检测到高水平的细胞因子并发现 CART细胞浸润肺组织。一个解释是靶抗原在正常肺组织中有表达。为了提高CART治疗安全 性和有效性，一个保守的剂量递增方法是在2天或以上分散T细胞输入剂量，不断监测毒性 迹象，阻止可能诱发大规模反应的进一步T细胞输入。用单克隆抗体封闭靶抗原来缓解脱靶 反应也是必要时的一种选择。最近还提出了引入自杀基因的方案，必要时立即启动CART自 杀，目前在III期临床试验。CART疗法另一副作用是细胞因子风暴。据报道早期CART治疗时 60%的病患要住ICU。现在用剂量递增方法可大大减少细胞因子风暴的产生。
[0008] 总之，嵌合抗原受体CAR能与革El抗原高亲和性结合而不受中枢耐受的影响，这一特 性使得CAR的免疫治疗能够克服以往免疫治疗的大部分缺陷。到目前为止大多数临床CART 引人注目的结果都来自治疗血液疾病，针对实体瘤的CART临床也开始起步。CART疗法的风 险在于抗原受体的非特异性造成的脱靶效应。
【发明内容】
[0009] 本发明要解决的技术问题是提供一种食管癌相关的嵌合抗原受体T细胞及其制备 方法，为食管癌的治疗提供一个新的技术方向。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
[0011] 一种嵌合抗原受体τ细胞，该嵌合抗原受体τ细胞以淋巴τ细胞为宿主，在淋巴τ细 胞的核基因组中通过核转染整合有SEQ ID NO: 1所示的基因。
[0012] 上述嵌合抗原受体T细胞以淋巴T细胞为宿主，在淋巴T细胞的表面含有SEQ ID NO: 1所示基因表达的抗原受体。
[0013] 上述嵌合抗原受体T细胞的制备方法，首先将SEQ ID NO:1所示的基因转入非病毒 载体，然后通过核转染技术将上述基因整合到淋巴T细胞的核基因组中，使得上述基因在淋 巴T细胞表面表达，将非特异性的淋巴细胞定向改造为能够识别并对肿瘤细胞进行靶向杀 伤的特异性嵌合抗原受体T细胞。
[0014] 上述嵌合抗原受体T细胞的制备步骤包括： AjBMC分离 A-1、将新鲜血液转移到50 mL离心管中，用生理盐水按照体积比1:1进行稀释，上下吹 打3-5次混匀，将6 mL Ficoll溶液加入到15 mL离心管中，竖直放置到水平台面上静置备 用;将稀释好的血液8 mL用移液管缓慢均匀加入上述含Ficoll溶液的离心管中； A-2、将加好血液与Ficoll溶液的离心管轻轻转移至离心机中，在转移离心管过程中要 减少晃动，保持离心管竖直，以避免打破液面分层，室温400g离心30分钟； A-3、离心结束后，轻轻转移离心管至超净台中，用移液器吸取中间的白膜层即淋巴细 胞层，吸取操作中避免吸取到下层或上层的细胞，避免造成污染，然后转移至新的50 mL离 心管中； A-4、加30 mL生理盐水至上述转移出来的淋巴细胞中，吹打混匀，60-100g室温离心 10分钟，重复洗涤淋巴细胞，去除上清，加入完全培养基重悬细胞； A-5、计数调整密度为5*105细胞/ml，预先处理过的12孔板中每孔加入1ml细胞;将培养 板放置于37°C、5% (体积比)CO2的培养箱培养48小时； B、 慢病毒感染 B-I、收集步骤A所得PBMC，室温300g离心4min，调整密度为5*105细胞/ml，新的12孔板 中每孔加入1ml细胞，实验组加入7.5ul EGFR二代CAR的慢病毒，病毒滴度为2*108/mL，M0I = 3;对照组加入7.5ul对照病毒，病毒滴度亦为2*108/mL，M0I=3，每孔加入TRANS B感染试剂； B-2、将细胞培养板置于37°C，5% (体积比)CO2培养箱培养； B-3、培养第三天每孔加入1ml新鲜的培养基，继续培养；。
[0015] B-4、培养第七天计数计算扩增倍数； C、 表型和分型检测 C-1、计数每个细胞取出1.0 xlO6个，lOOOrpm，离心3min，加入IOOul FACS buffer重 悬细胞，加入 15ul APC anti-human CD8、15ul PE anti-human CD4、15ul PerCY5.5 anti-human CD3; C_2、4°C避光孵育30min，1000rpm，离心3min，去掉上清加入FACS buffer再洗两遍； C-3、加入150ul FACS buffer重悬细胞，FACS检测荧光;确定所制备细胞GFP的表达，然 后利用BD Accure C6 software对数据进行处理分析，即可确定T细胞的感染率，完成嵌合 抗原受体T细胞的制备。
[0016] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于:本发明的方法制备的嵌合抗原受体T 细胞具有特定的食管癌相关功能活性，对食管癌的治疗具有重要的潜在和实际价值，为食 管癌的治疗提供一个新的技术方向。
【附图说明】
[0017] 图1为二代和三代的CAR结构示意图。
[0018] 图2显示CART细胞(即嵌合抗原受体T细胞)的制备流程。
[0019] 图3显示CART-EGFR及CART-对照组的GFP表达结果。
[0020] 图4显示CART-EGFR细胞分群。
[0021] 图5显示CART-对照组细胞分群。
[0022]图6显示流式细胞仪检测细胞EGFR表达的结果。
[0023] 图7显示CART-EGFR及CART-对照组细胞分泌结果。
[0024] 图8显示CART-EGFR、CART-对照组对靶细胞及非靶细胞的杀伤作用。
[0025] 图9显示CART-EGFR、CART-对照组GFP细胞检测结果。
【具体实施方式】
[0026]以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市 售产品，均能够通过市场购买直接获得。
[0027] 实施例1、CAR-EGFR的设计与构建 1- 1、CAR的设计说明。经统计，目前临床实验中使用最多的CAR结构包括二代和三代CAR (参见附图1)，在有关的临床报道中，二代CAR报道较多，其中尤其以宾夕法尼亚大学主导的 CAR结构疗效显著(NCT01626495，NCT01029366)，因此我们采用了此二代CAR框结构。
[0028] 1-2、CAR的结构及构建。CAR-EGFR序列包括如下几个部分：CD8-pre，EGFR- scFv， CD8铰链+跨膜，4-lBB(CD137)，CD3G。其完整序列参见SEQ ID N0:1。
[0029] 1-3、CAR对照组的结构及构建。CAR-对照组序列结构包括:CD8-pre，EGFR- scFv， □)8-Δ〇)3ζ。其完整序列参见SEQ ID N0:2。
[0030] 实施例2、CAR-EGFR修饰的T细胞(CART-EGFR)的制备与表型验证 2- 1、CART-EGFR及CART-对照组的制备。CART-EGFR及CART-对照组制备流程如附图2所 示。具体包括如下内容： 2_1_1、实验试剂和实验仪器： 实验试剂包括： FicolI-Paque PLUS(GE，cat#17-1440_02) 完全培养基TexMACS (Miltenyi Biotechnolog，cat#170-076-309)+IL-2 (Miltenyi Biotechnolog，cat#l30-097-748) PerCP5·5 anti-human CD3(BD，cat#552852) PE anti-human CD4(BD，cat#555347) APC anti-human CD8(BD，cat#555369) FACS buffer:PBS+2.5%FBS TRANS B〇
[0031] 实验仪器包括： 离心机:湘仪L550 流式细胞仪:m) C6 C02培养箱:ESCO MC0-20AIC 细胞计数仪:Cellometer Auto 1000。
[0032] 2-1-2、PBMC分离：将新鲜血液转移到50 mL离心管中。用生理盐水按照1:1(体积 比）进行稀释，轻轻上下吹打3-5次混匀。将6 mL Ficoll加入到15 mL离心管中，竖直放置 到水平台面上静置备用。将稀释好的血液(总体积8 mL)用移液管缓慢均匀加入到竖直放置 在台面的含Ficoll溶液的离心管中。将加好血液与Ficoll的离心管轻轻转移至离心机中。 在转移离心管过程尽量减少晃动，保持离心管竖直，以避免打破液面分层。室温400g离心30 分钟。离心结束后，轻轻转移离心管至超净台中。用移液器吸取中间的白膜层（即淋巴细胞 层)转移至新的50 mL离心管中。尽量避免吸取到下层或上层的细胞，避免造成污染。加入30 mL生理盐水至上述转移出来的淋巴细胞中，轻轻吹打混匀，60-100g室温离心10分钟。 重复洗涤淋巴细胞，去除上清，加入一定量的完全培养基重悬细胞。计数调整密度为5*10 5 细胞/ml，预先处理过的12孔板中每孔加入lml。将培养板放置于37° C，5%C02培养箱培养48 小时。
[0033] 2-1-3、慢病毒感染:收集上述PBMC，室温300g离心4min，调整密度为5*105细胞/ ml，新的12孔板中每孔加入1ml细胞，实验组加入7.5ul EGFR二代CAR的慢病毒(慢病毒的制 备是比较常规化的技术，可以自行制备或提供本发明的基因序列交由上海吉凯基因化学技 术有限公司制备）；病毒滴度为2*10 8/mL，M0I=3;对照组加入7.5ul对照病毒，病毒滴度为2* 108/mL，M0I=3,每孔加入一定的TRANS B感染试剂(TRANS B感染试剂购自上海吉凯基因化 学技术有限公司，其用量依据产品说明书确定）。将细胞培养板置于37° C，5%C02培养箱培 养。第三天每孔加入1ml新鲜的培养基，继续培养。第七天计数计算扩增倍数。
[0034] 本次制备，初始PBMC细胞量均为1E+6，第七天时实验组PBMC细胞量为2.50E+07，其 中97.9%为⑶3 +T细胞，见图2，细胞扩增倍数约为25倍;对照组PBMC细胞量为1.77E+07，细 胞扩增倍数约为17倍，见表1。
[0035] 表1 CART-EGFR及CART-对照组细胞增殖
2-2、CART-EGFR表型检测。实验目的：确定CART-EGFR及CART-对照组的感染效率。实验 设计:流式细胞仪检测所制备细胞GFP的表达。计数每个细胞取出1.0 XlO6个，lOOOrpm，离 心3min，加入IOOul FACS buffer 重悬细胞，加入 15ul APC anti-human CD8、15ul PE anti-human CD4、15ul PerCY5.5 anti-human 003。4。〇避光孵育30min，1000rpm，离心 3min，去掉上清加入FACS buffer再洗两遍。加入150ul FACS buffer重悬细胞，FACS检测 焚光。用I3D Accure C6 software对数据进行处理分析。实验结果及分析：CART-EGFR及 CART-对照组GFP表达结果如图3。如图3所示，CART-EGFR感染效率约为56.1%，CART-对照组 感染效率约为19.3%。
[0036] 2-3、CART的细胞分群检测。实验目的：确定CART-EGFR的细胞中T细胞的亚群分布 特征。实验设计:流式细胞仪检测所制备细胞表面标志物，检测标的及意义如下表2所示。 [0037] 表2 T细胞亚群分布
实验结果及分析:CART-EGFR及CART-对照组细胞分群检测结果如图4、5。由上述结果可 知，所制备的CART-EGFR细胞分群如表3;所制备的CART-对照组细胞分群如表4。
[0038] 表3 CART-EGFR细胞亚群分布比例
实施例3、CART-EGFR的功能验证--靶细胞的验证 实验目的:检测靶细胞和非靶细胞上EGFR的表达。实验设计:使用EGFR的流式抗体对靶 细胞(Ecal09)及对照细胞(MCF7)进行检测。实验结果与分析：流式细胞仪检测Ecal09及 MCF7 EGFR表达结果如图6，结果显示阴性对照MCF7中EGFR表达较低，但靶细胞Eca 109中 EGFR高表达。
[0039 ] 实施例4、CART-EGFR的体外功能验证--细胞因子分泌实验。
[0040] 实验目的:通过检测CART-EGFR细胞与靶细胞共同孵育后，细胞因子分泌是否有上 升判断CART是否有功能。实验设计:分别对比CART-EGFR、CART-对照组与靶细胞和非靶细胞 共同孵育后，培养基上清中细胞因子的分泌情况。试剂包括:Human TH1/TH2 cytokine CBA 1^七（80，〇3邙550749)。细胞（〇61111116)包括：]\?^7(]\^(1111111:01^]\1+10°/^85)$〇厶109 (Medium:DMEM+10%FBS)。仪器包括:离心机:湘仪L550;流式细胞仪:BD C6。实验方法包括： 4-1、细胞因子分泌:收集靶细胞，用稀释缓冲液将细胞洗涤一次，1000 rpm 3min离心， 弃上清，以含2% FBS的1640重悬细胞，计数，最终将细胞稀释到1*106个/ml浓度;收集CART 细胞(效应细胞），用稀释缓冲液将细胞洗涤一次，1000 rpm 3min离心，弃上清，2% FBS的 1640重悬细胞，计数，最终将细胞稀释到1*106个/ml浓度;将IOOul靶细胞和IOOul CART细 胞1:1混合加入96孔板中，37°C、5%C〇2共同培养20-24小时；1000 rpm 5min离心，收集上清检 测细胞因子。
[0041] 4-2、细胞因子检测:准备15ml离心管，在瓶盖上标注1，将标准品转移至EP管内，并 向其中加入标准品稀释液2ml，轻柔颠倒混匀，室温防止15min-20min平衡。取9支1.5ml EP 管，并向每管中加入300ul标准品稀释液，瓶盖上标注编号2-9,在1管中取300ul至2管内混 匀；在2管内取出300ul至3管内，依次类推进行2倍梯度稀释，另取一支1.5ml EP管，加入 300ul标准品稀释液作为阴性对照。确定好需要检测的细胞因子及样品个数。取出待检测的 细胞因子捕获珠子瓶，用力混匀。每种珠子取出（待检测样品数+标准品数+阴性对照数)* IOul的捕获珠子量。并将每种珠子进行涡轮震荡混匀。用标准品稀释液对样品进行稀释(稀 释倍数可自行决定，如1:10、1:100等)取N个1.5ml EP管(N=样品数+标准品数+对照数）向 每管(标准品、样品、阴性对照）中加入50ul混合珠子;并向各管中加入相应待测试剂(标准 品、样品、对照）50ul以及PE Detection Reagent 50ul，充分混合后，避光室温孵育3小时。 向每管中加入1ml wash buffer，轻柔吹勾后200g离心5分钟。小心吸去上清，并向每管中加 入300ul wash buffer，并重悬沉淀。将样品进行流式细胞仪检测。用BD的FCAP Array v3软 件对数据进行处理分析。
[0042] 4-3、实验结果与分析:本次实验分别检测了 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-γ的分泌，其中IL-4和TNF-a分泌水平较低，变化不明显，结果如图7所示，CART-EGFR在存在 靶细胞时，细胞因子的分泌高于CART-对照组，结果显示CART-EGFR具有一定的功能活性。 [0043]实施例5、CART-EGFR的体外功能验证--细胞杀伤能力检测。
[0044] 实验目的：检测CART-EGFR及CART-对照组的杀伤能力。实验设计:通过LDH释放实 验，判断CART细胞对靶细胞的特异杀伤。实验结果与分析:CART-EGFR和CART-对照组对靶细 胞及非靶细胞的裂解效应如图8。与CART-对照组相比，CART-EGFR对靶细胞具有一定杀伤活 性，在CART-EGFR:靶细胞比例为20:1共培养4hr后，靶细胞裂解率为40.42%。
[0045] 实施例6、存在靶细胞时CART-EGFR的增殖实验 实验目的：检测CART-EGFR及CART-对照组在靶细胞存在时的增殖作用。实验设计： CART-EGFR及CART-对照组与靶细胞比例为2:1，共同培养48小时，流式细胞仪检测带有GFP 细胞的增殖。实验结果与分析:CART-EGFR和CART-对照组细胞增殖结果如图9,在靶细胞存 在条件下，CART-EGFR及CART-对照组增殖不明显。
[0046] 由上述试验例可知，利用本发明的抗原受体基因制备的嵌合抗原受体T细胞CART-EGFR相比CART-对照组展现出了一定的功能活性，本发明的基因针对食管癌的治疗具有重 要的潜在和实际价值。
[0047] 上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一 限制条件。
【主权项】
1. 一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于:该嵌合抗原受体T细胞以淋巴T细胞为宿主， 在淋巴Τ细胞的核基因组中通过核转染整合有SEQ ID NO: 1所示的基因。2. 根据权利要求所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于:所述嵌合抗原受体T细胞以 淋巴T细胞为宿主，在淋巴T细胞的表面含有SEQ ID NO: 1所示基因表达的抗原受体。3. 权利要求1所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于:首先将SEQ ID NO: 1所 示的基因转入非病毒载体，然后通过核转染技术将上述基因整合到淋巴T细胞的核基因组 中，使得上述基因在淋巴T细胞表面表达，将非特异性的淋巴细胞定向改造为能够识别并对 肿瘤细胞进行靶向杀伤的特异性嵌合抗原受体T细胞。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:其制备步骤包括： A、 PBMC分离 A-1、将新鲜血液转移到50 mL离心管中，用生理盐水按照体积比1:1进行稀释，上下吹 打3-5次混匀，将6 mL Ficoll溶液加入到15 mL离心管中，竖直放置到水平台面上静置备 用;将稀释好的血液8 mL用移液管缓慢均匀加入上述含Ficoll溶液的离心管中； A-2、将加好血液与Fico 11溶液的离心管轻轻转移至离心机中，在转移离心管过程中要 减少晃动，保持离心管竖直，以避免打破液面分层，室温400g离心30分钟； A-3、离心结束后，轻轻转移离心管至超净台中，用移液器吸取中间的白膜层即淋巴细 胞层，吸取操作中避免吸取到下层或上层的细胞，避免造成污染，然后转移至新的50 mL离 心管中； A-4、加30 mL生理盐水至上述转移出来的淋巴细胞中，吹打混匀，60-100g室温离心 10分钟，重复洗涤淋巴细胞，去除上清，加入完全培养基重悬细胞； A-5、计数调整密度为5*105细胞/ml，12孔板中每孔加入lml细胞;将培养板放置于37 °C、 5%体积比的CO2的培养箱培养48小时； B、 慢病毒感染 B-1、收集步骤A所得PBMC，室温300g离心4min，调整密度为5* 105细胞/ml，新的12孔板 中每孔加入lml细胞，实验组加入7.5ul EGFR二代CAR的慢病毒，病毒滴度为2*108/mL，M0I = 3;对照组加入7.5ul对照病毒，病毒滴度亦为2*108/mL，M0I=3，每孔加入TRANS B感染试剂； B-2、将细胞培养板置于37°C，5%体积比的C02培养箱培养； B-3、培养第三天每孔加入lml新鲜的培养基，继续培养； B-4、培养第七天计数计算扩增倍数； C、 表型和分型检测 C-1、计数每个细胞取出1.0 xlO6个，lOOOrpm，离心3min，加入100ul FACS buffer重悬 细胞，加入 15ul APC anti-human CD8、15ul PE anti-human CD4、15ul PerCY5.5 anti-human CD3； C_2、4°C避光孵育30min，1000rpm，离心3min，去掉上清加入FACS buffer再洗两遍； C-3、加入150ul FACS buffer重悬细胞，FACS检测荧光;确定所制备细胞GFP的表达，然 后利用BD Accure C6 software对数据进行处理分析，即可确定T细胞的感染率，完成嵌合 抗原受体T细胞的制备。
【文档编号】C12N15/62GK105861531SQ201610251247
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月21日
【发明人】汪治宇
【申请人】汪治宇