嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化her1靶向性的nkt细胞及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及过继免疫治疗中的一种嵌合抗原受 体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化肥R1祀向性的NKT细胞 (CARHER1-NKT细胞）及其应用。
【背景技术】
[0002] EGFR(epithelialgrowthfactorreceptor,表皮生长因子受体）即肥R1,是原癌 基因c-erbBl的表达产物，属于人类表皮生长因子受体（肥时家族，其本身具有酪氨酶激酶 活性，一旦与表皮生长因子巧G巧组合可启动细胞核内的有关基因，从而促进细胞分裂增 殖。肥R1在多种恶性肿瘤中高表达，研究发现肥R1表达于大多数肺癌患者，表达水平达到 80%，其表达水平与肺癌疾病的进展及转移有关。尽管最近肺癌的治疗已经获得一定的进 展，但是仍然未提高患者的生存率，因此亟需探讨新的疗法来克服送一困扰。
[0003]目前，在治疗进展期肥R1阳性肺癌患者时，肥R1酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinaseinhibitors,TKIs)已经处于临床研究阶段，但是，临床结果表明，仅部分肺癌患者 采用肥R1酪氨酸激酶抑制剂治疗有效，并且患者最终会产生一定的耐药性，从而影响药物 的疗效。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了克服现有技术中采用肥R1酪氨酸激酶抑制剂治 疗进展期HER1阳性肺癌患者时引起的耐药性的缺陷，提供一种嵌合抗原受体 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化肥R1祀向性的NKT细胞 (CAR肥R1-NKT细胞）及其应用，嵌合抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的ΝΚΤ细胞 在治疗进展期肥R1阳性肺癌时，能够有效避免采用肥R1酪氨酸激酶抑制剂时引起的耐药 性，对肺癌细胞具有一定的特异祀向杀伤活性。
[0005] 本发明的发明人在研究中意外发现，采用嵌合抗原受体 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的ΝΚΤ细胞治疗进展期肥R1阳性肺癌时，能够有效避免采 用肥R1酪氨酸激酶抑制剂时引起的耐药性，对肺癌细胞具有一定的特异祀向杀伤活性。
[0006]因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合 抗原受体为肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由肥RlScFv、CD8的较链区化inge区）和跨膜区、 CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。
[0007] 第二方面，本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。
[0008] 第Η方面，本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。
[0009] 第四方面，本发明提供了一种工程化肥R1祀向性的ΝΚΤ细胞，所述ΝΚΤ细胞是上 述嵌合抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的ΝΚΤ细胞。
[0010] 第五方面，本发明提供了上述工程化肥R1祀向性的ΝΚΤ细胞在制备用于治疗肿瘤 的制剂中的应用。
[0011] 在治疗进展期肥R1阳性肺癌时，本发明的嵌合抗原受体 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞，即工程化肥R1祀向性的NKT细胞能够特异 性结合肥R1抗原，明显延长免疫细胞在患者体内的存活时间，增强免疫细胞祀向识别肺癌 细胞表面HER1抗原的能力，加强对肺癌细胞的特异杀伤活性，而且确实能够有效避免采用 肥R1酪氨酸激酶抑制剂时引起的耐药性。本发明的工程化肥R1祀向性的ΝΚΤ细胞为治疗 进展期肥R1阳性肺癌提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。
[0012] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予W详细说明。
【附图说明】
[0013]图1为流式细胞术对分离培养的ΝΚΤ细胞表型分析的结果。
[0014] 图2为本发明的慢病毒表达载体PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶Mlul/ Sail双酶切片段的电泳鉴定图。
[001引 图3为本发明的慢病毒表达载体pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切 酶BamHI/Sall双酶切片段的电泳鉴定图。
[0016] 图4为本发明的慢病毒表达载体pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的结构示意 图，其中，逆时针序列为正向基因片度，顺时针为反向基因片段。
[0017] 图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的病毒浓 缩液对ΝΚΤ细胞的感染效率。
[0018] 图6为流式细胞术检测嵌合抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的ΝΚΤ细 胞（CARHER1-NKT细胞）表型鉴定的结果。
[0019] 图7为本发明的CARHER1-NKT细胞对人肺癌细胞杀伤作用的细胞毒性分析图。
[0020] 图8为本发明的CAR肥R1-NKT细胞对进展期肥R1阳性肺癌患者治疗过程中，患者 病灶部位肥R1阳性肺癌细胞数目的变化。
[002。 图9为本发明的CAR肥R1-NKT细胞对进展期肥R1阳性肺癌患者治疗过程中，患者 病灶部位影像图变化。
【具体实施方式】
[0022] W下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0023] 本发明提供了 一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由肥RlScFv、CD8的较链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构 域和〔03ζ的胞内信号结构域串联构成。优选情况下，嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO. 1 所示。
[0024] 本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。优选情况下，编码上述嵌合抗原受 体的基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0025] 本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。优选情况下，重组表达载体为慢病 毒表达载体。对于慢病毒表达载体没有特别的限定，只要能够与辅助载体共转染包装细胞 如293T包装细胞，获得病毒浓缩液及嵌合抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NTK 细胞即可，优选情况下，慢病毒表达载体为pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ。
[0026] 对于慢病毒表达载体ρΚΡΤ-ΗΕΚ15οΡν-〔08-〔0137-〔03ζ的制备方法没有特 别的限定，可W为本领域技术人员能够想到的各种方法，优选情况下，慢病毒表达载体 pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制备方法包括W下步骤：
[0027] (1)从ΝΚΤ细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞 内信号结构域和〔03ζ的胞内信号结构域，并克隆至载体pWPT-GFP中，构建得到 PWPT-CD8-CD137-CD3ζ；
[002引 似合成编码大鼠生长激素信号肤和肥RlScFv的核巧酸序 列，并克隆至PWPT-CD8-CD137-CD3 ζ中，经测序验证后得到序列正确的pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。
[002引步骤（1)中，对于从ΝΚΤ细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的 胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域的方法没有特别的限定，可W为本领域常用的 各种方法，例如可W为RT-PCR法。其中，ΝΚΤ细胞可W通过分离人静脉血中的单个核细胞， 然后进行培养获得。
[0030] 具体地，得到PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的方法可W包括；提取ΝΚΤ细胞的总RNA， 逆转录获得ΝΚΤ细胞cDNA，W得到的ΝΚΤ细胞cDNA为模板，利用引物Ρ1(SEQIDNO. 11)和 P2(SEQIDNO. 12)进行PCR扩增获得CD8基因的hinge区和跨膜区（SE