一种检测抗cd19的嵌合抗原受体t细胞对白血病细胞抑制作用的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于生物学嵌合抗原受体T细胞技术领域，具体是一种检测抗CD19的嵌合 抗原受体T细胞对白血病细胞抑制作用的方法。
【背景技术】
[0002] 嵌合抗原受体T细胞（CAR T细胞）是表面表达识别特定抗原并能传递信号的嵌 合型受体的T细胞。T细胞在抗肿瘤中发挥重要作用，CAR T细胞是表达这样一类分子的 T细胞：胞外段是抗体重链和轻链可变区通过一条肽段相连接，形成单链可变区（ScFv)，胞 内段是各种信号传导分子的胞内段嵌合体，包括⑶3zeta、⑶28、0Χ-40、4-1ΒΒ等，跨膜区则 来自其他分子（如⑶8,⑶4,⑶28和⑶3zeta)的跨膜区。CAR T细胞通过抗原-抗体识别 模式对肿瘤细胞表面的特异分子进行识别，然后通过其胞内的信号传导进行激活、增殖并 发挥细胞杀伤功能。CAR T细胞在肿瘤免疫治疗中的应用前景广阔，市场价值巨大。然而， CAR T细胞免疫治疗在中国的发展滞后于发达国家，且临床应用缺乏严格规范。而且现有 CAR T细胞并不能治疗所有类型的肿瘤，新型CAR T细胞是未来肿瘤免疫治疗的新方向。但 新型CAR T细胞的安全可靠性需要得到验证后才可以在人体进行临床试验。目前，验证CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤主要是通过体外共培养实验，但体外共培养实验并不能真实反映 CAR T细胞在肿瘤患者体内的作用，而且不同肿瘤患者对同一 CAR T细胞的反应也不同，因 此对每个患者进行个体化的临床前试验可为CAR T细胞治疗的安全性和有效性提供保障。
[0003] 2013年，CAR T细胞免疫疗法被列为美国《科学》杂志年度十大科学突破榜首。但 该免疫疗法安全性和有效性有待提高，加上其治疗费用昂贵，因此目前只停留在临床试验 阶段。临床试验具体程序包括：（1)从患者外周血中分离出T细胞；（2)用CD3、CD28抗体对 T细胞进行刺激活化和扩增；(3)构建包含嵌合抗原受体基因的逆转录病毒或慢病毒；(4) 用病毒转染T细胞使T细胞表达嵌合抗原受体；（5)将表达嵌合抗原受体的T细胞重新输 回患者本人体内；(6)监测患者的各项提示该疗法效果的临床指标，这种直接以人体为对 象的验证方法，并不能实现产业化。
[0004] 综上，现有技术中验证CAR T细胞对肿瘤细胞的抑制作用时存在以下缺陷：不能 真实的反映 CAR T细胞对于肿瘤细胞的抑制作用，无法保证准确性，也不能实现产业化，这 些缺陷都制约着CAR T细胞应用的发展。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中无法保证验证CAR T细胞对肿瘤细胞抑制作用的准确性，也不能 实现产业化的缺陷，本发明提供一种抗CD19嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞抑制作用的 方法，其实现的目的是，得到一种安全、可靠、精确度高、可产业化应用的验证方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，本发明公开的一种检测抗CD19的嵌 合抗原受体T细胞对白血病细胞抑制作用的方法，包括如下步骤，（1)将表达抗CD19的嵌 合抗原受体T细胞与白血病细胞等比例混合后移植到免疫缺陷小鼠模型体内，抗CD19的嵌 合抗原受体T细胞的保藏号CCTCCNO: C201503，该细胞保藏于中国典型培养物保藏中心（武 汉），地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内（武汉大学第一附小对面）， 武汉大学保藏中心，保藏日期为2015年2月13日，且该保藏中心已于2015年3月12日对 本发明的抗CD19的嵌合抗原受体T细胞检测完毕；一般细胞等比例指的是细胞个数等比 例；
[0007] (2)采集免疫缺陷小鼠模型的外周血细胞，用荧光标记的抗人⑶45和⑶19抗体对 外周血细胞染色；
[0008] (3)将步骤（2)染色后的细胞采用流式细胞仪进行检测，根据白血病细胞的数量 即可检测出抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞的抑制作用。本发明设计的检测 方法，将人白血病细胞移植入免疫缺陷小鼠模型中，可以了解个体差异的抗CD19的嵌合 抗原受体T细胞对白血病细胞的抑制作用，真实反映对人体白血病细胞的抑制作用，能够 保证检测抑制作用方法的高效性、精确性。
[0009] 作为优选，免疫缺陷小鼠模型为N0D/SCIDIL2Rg-/_免疫缺陷小鼠，NOD/ SCIDIL2Rg-/_免疫缺陷小鼠是指N0D/SCID小鼠敲除IL-2Rgamma基因后获得的高度免疫缺 陷型小鼠，具体详见公开号为103409468A的专利文件，该小鼠的建立方法也是本申请人开 发设计完成的，已可以通过商业方式获得，N0D/SCIDIL2Rg-/_免疫缺陷小鼠体内缺乏T、B 和NK三种对免疫功能至关重要的细胞，该小鼠体内可以生长人的细胞和组织，借助该小鼠 模型，较真实地反映人体内环境，进一步保证检测抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病 细胞抑制作用方法的精确性。
[0010] 进一步的，白血病细胞为B细胞白血病细胞。
[0011] 进一步的，步骤（2)中还可以采集免疫缺陷小鼠模型的骨髓、脾脏细胞，然后用荧 光标记的抗人CD45和CD19抗体对骨髓、脾脏细胞染色。采取骨髓、脾脏细胞可以保证检测 抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞的抑制作用的准确性。
[0012] 进一步的，获得表达抗⑶19的嵌合抗原受体T细胞的方法包括如下步骤，（1)合 成抗⑶19的嵌合抗原受体细胞的基因，合成的基因记为CAR19 ;
[0013] ⑵慢病毒质粒的构建：①合成的CAR19基因整合在pUC57质粒中，记为 PUC57-CAR19质粒；②用限制酶PmeI和SpeI对pWPXLd-EGFP和pUC57-CAR19进行双酶切， 再通过琼脂糖电泳、胶回收试剂盒MGEN切胶回收提取到CAR19基因片段和pWPXLd-EGFP 骨架大片段；③用Solution I将CAR19和pWPXLd-EGFP片段连接起来，反应体系为5ul Solution I 加 4ul CAR19 和 Iul pWPXLd-EGFP 片段，16°C反应 2h，连接产物转化到 T0P10 感受态大肠杆菌；④将转化后感受态细菌涂布在氨苄青霉素琼脂平板上，37°C过夜培养； ⑤第二天挑取4个细胞克隆至2ml含50ug/ml氨苄青霉素 LB培养基中，37°C，250rpm培养 12h，用质粒小提试剂盒MGEN提取4管细菌中的质粒；⑥通过PmeI和SpeI双酶切进行鉴 定，构建好的质粒记为pWPXLd-CAR19-EGFP ;⑦采用质粒大提试剂盒提取慢病毒包膜质粒 PMD2.G、包装质粒 psPAX2 以及 pWPXLd-CAR19-EGFP 质粒待用；
[0014] (3)CAR19慢病毒的制备：通过293T细胞包装慢病毒，具体操作如下：①用 DMEM高糖培养基加 10% FBS和1 %双抗培养293T细胞至150mm培养皿，待293T细胞 密度达80-90 %时，换成DMEM高糖培养基加 1% FBS和1 %双抗培养2-6h后，用PEI将 pWPXLd-CAR19-EGFP 或对照质粒 pWPXLd-EGFP、pMD2. G 和 psPAX2 三个质粒转化 293T 细胞， 每个 150mm培养皿转化 9 μ g 的 pWPXLd-CAR19-EGFP 或对照质粒pWPXLd-EGFP，3 μ g 的 pMD2. G和12 μ g的psPAX2, PEI为72ug ;?转化后的24h、48h和72M夂集三次上清，上清经2500g 离心后，通过0. 45 μ m过滤器过滤后，超高速离心机28000rpm离心I. 5h，立即去上清后，每 个超速离心管加入200 μ I PBS，置于4°C过夜重悬，次日将含慢病毒的PBS收集即可；
[0015] (4)T细胞的分离纯化：首先通过Ficol 1密度梯度法分离出血液中的单个核细 胞，经红细胞裂解液裂解去除红细胞后，再通过MACS磁珠分选出T细胞；
[0016] (5) T细胞的活化增殖：①预先包被抗⑶3 0KT-3和⑶28抗体：用PBS将抗⑶3和 ⑶28抗体稀释成1 μ g/ml和2 μ g/ml，加入六孔板中，每孔Iml，37 °C培养箱包被2h ;②T细 胞用含10% FBS和1 %双抗的RPMI-1640培养基稀释至2. 5xl06个/ml，将6孔板中的包被 液吸掉，加入每孔3ml的含T细胞培养基，③将T细胞放在37°C，5% 0)2培养箱中，刺激T 细胞48h ;
[0017] (6) T细胞的慢病毒转染：将刺激后的T细胞重悬起来，300g，5min离心去上清后 换上新鲜的含8 μ g/ml polybrene的RPMI-1640培养基，在不同孔中分别加入表达GFP和 CAR19的慢病毒，根据慢病毒滴度，MOI设为10。37°C，5% CO2培养箱培养24h后，重悬细 胞，300g，5min离心去上清后换上新鲜的含300IU/ml IL-2的RPMI-1640培养基，37°C，5% CO2培养箱培养24h后，流式检测GFP呈阳性，即说明得到了表达抗CD19的嵌合抗原受体T 细胞。
[0018] 进一步的，步骤（6)中得到表达抗⑶19的嵌合抗原受体T细胞后，还可以将该 细胞扩增：将得到的表达抗⑶19的嵌合抗原受体T细胞用含浓度为300IU/ml IL-2的 RPMI-1640培养基进行培养，表达抗CD19的嵌合抗原受体T细胞在培养基中的浓度为 1-2χ106个细胞/ml，2-3天进行一次培养基半量换液，并对T细胞进行计数，培养2周后可 获得扩增后的T细胞，经上述方法对获得的表达抗CD19的嵌合抗原受体T细